JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:43 dk. • April 30th, 2023
Eksozomlar, kültürlenmiş hücreler tarafından süpernatanın içine salgılanan hücre dışı veziküler yapılardır. Bir eksozom bloğu hazırlamak için, bir tüpte eksozom içeren bir kültür süpernatanı alarak başlayın. Sağlam eksozomları peletlemek için tüpü yüksek hızda santrifüjleyin. Kalan süpernatanı atın.
Eksozom peletini sabitleme tamponunda bulunan glutaraldehit ile işlemden geçirin. Eksozomların morfolojisini korumak için karışımı istenen süre boyunca buz üzerinde inkübe edin. Gluteraldehit eksozomlara sızar ve proteinleri çapraz bağlar. Sabitleme tamponu, aşağı akış fiksasyon işlemi için eksozomları nötr pH'da tutar.
Glutaraldehit içeren tamponu atın ve membran çift tabakasını geçirgen hale getiren ve eksozomlarda bulunan lipitleri sabitleyen ikincil bir fiksatif olan osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin. Osmiyum tetroksit çözeltisini çıkarın ve eksozomları bir dizi artan aseton konsantrasyonu ile muamele edin. Bu işlem eksozomları kurutur.
Mutlak asetonu, gömme orta-aseton karışımıyla değiştirin. Yavaş yavaş, bu karışımdaki gömme ortamının oranını arttırın.
Eksozom içeren gömme karışımını istenen kalıplara dökün. Kalıpları yüksek sıcaklıkta fırında kurutun. Bu, eksozomların etrafındaki gömme ortamının polimerizasyonuna yol açacak ve bloklara yol açacaktır.
Saflaştırılmış eksozom peletini sabitlemek için, pH 7.0'da 0.1 M sodyum kakodilat çözeltisine 1 mililitre %2.5 glutaraldehit ekleyin. Lipid çift katmanlı vezikülleri 4 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Daha sonra, fiksatifi çıkarın ve peletleri 1 mililitre 0.1 M sodyum kakodilat tampon çözeltisi ile oda sıcaklığında 10 dakika durulayın.
Ardından, numuneleri 1 mililitre% 2 osmiyum tetroksit ile 4 santigrat derecede 1 saat boyunca sabitleyin. Sabitleyiciyi çıkarın ve eksozom peletini 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile üç kez durulayın, tamponu her 10 dakikada bir değiştirin. Ardından, numuneyi bir dizi kademeli aseton konsantrasyonunda her biri 10 dakika çalkalayarak kurutun.
Daha sonra, üç kısım aseton ve bir kısım düşük viskoziteli gömme karışımından oluşan bir çözeltiyi karıştırın. Asetonu bu karışımla değiştirin ve numuneyi 30 dakika inkübe edin. Düşük viskoziteli gömme ortamının oranını artırmaya devam edin, her adımda 30 dakika inkübe edin.
En sonunda, eksozom peletini düşük viskoziteli gömme karışımının %100'ünde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi bir gömme kalıbı kullanarak saf düşük viskoziteli gömme karışımına gömün ve 65 santigrat derecede 24 saat pişirin.