$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Eksozomlar, kanser biyobelirteçleri olarak hizmet eden çeşitli biyomolekülleri çevreleyen küçük hücre dışı veziküllerdir.
Ekzozomal biyobelirteçleri görselleştirmek için, uygun elektron mikroskobu metal ızgaraları üzerinde desteklenen ultra ince reçine gömülü ekzozomal kesitlerle başlayın. Izgaraları glisin damlalarında inkübe edin. Glisin, tahlil ile etkileşimlerinin üstesinden gelmek için bölümlerdeki reaktif aldehit gruplarını bağlar ve nötralize eder.
Artık reaktifleri çıkarmak için numuneyi suyla durulayın. Daha sonra, numuneyi bir bloke edici tamponda inkübe edin. Tampon, numunedeki spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke eden serum proteinlerini taşır.
Daha sonra, numuneyi istenen birincil antikor çözeltisi içinde inkübe edin. Bu antikorlar, ekzozomal lümende lokalize olan hedef biyobelirteçlerini tanır ve bunlara bağlanır. Bağlanmamış antikorları uygun bir tamponla yıkayın.
Şimdi, numune taşıyan ızgaraları, birincil antikorlara bağlanan altın konjuge ikincil antikorlar içeren damlalara aktarın. Altın-nanopartiküller, hedef moleküllerin ince lokalizasyonunu görselleştirmek için elektron yoğun belirteçler olarak hizmet eder. Bağlanmamış ikincil antikorları uygun bir tamponla yıkayın.
Son olarak, karanlık koşullar altında, ızgaraları uranil asetat ve kurşun sitrat çözeltileri içinde sırayla inkübe edin. Bu ağır metal reaktifleri, numunedeki lipitler, proteinler ve glikojenler gibi organik moleküllerin kontrastını lekeleyerek ve artırarak onları arka plandan ayırır.
Lekeli bölümleri bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemleyin. Altın etiketli biyobelirteçler, ağır metal lekeli eksozom yapılarının lümeni içinde koyu renkli parçacıklar olarak görünür.
Başlamak için, serbest aldehit gruplarını söndürmek için 60 nanometre kalınlığında boyanmamış bölümler içeren ızgaraları 50 mikrolitrelik damlalar halinde 0.02 M glisin 10 dakika inkübe edin. Ardından, bölümleri 100 mikrolitre damıtılmış suda her biri 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Son durulamayı takiben,% 1 BSA içeren PBS'de bölümleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Daha sonra, ızgaraları 1 saat boyunca 50 ila 100 mikrolitrelik bir anti-KRS antikoru damlaları halinde inkübe edin.
Daha sonra, ızgaraları her biri 10 dakika boyunca beş kez% 0.1 BSA içeren bir PBS damlasında yıkayın. Daha sonra, ızgaraları uygun bir ikincil antikorun bir damlasına aktarın ve bölümleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Şimdi, ızgaraları her biri 10 dakika boyunca beş kez% 0.1 BSA içeren ayrı bir PBS damlası ile yıkayın. Karanlıkta 2 dakika boyunca% 20 uranil asetat ile bölümleri iki kez boyayın, ardından 10 dakika boyunca Reynold'un kurşun sitratını uygulayın. Lekeli bölümü bir transmisyon elektron mikroskobuna yerleştirin ve numuneyi 80 kV kullanarak görüntüleyin ve mikroskop yazılımını kullanarak görüntüleyin.