JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:10 dk. • April 30th, 2023
Eksozomların negatif boyanmasını gerçekleştirmek için - nano boyutlu, küresel veziküller - uygun bir elektron mikroskobu ızgarası alarak başlayın. Bir kızdırma deşarjı kullanarak ızgarayı hazırlayın. Bu işlem, numunelerin daha iyi yapışması için ızgara yüzeyini hidrofilik hale getirir.
Aynı anda, bir tüpte saflaştırılmış eksozomların bir süspansiyonunu alın. Tüpü paraformaldehit ile destekleyin - bir numune sabitleyici - ve inkübe edin. Paraformaldehit, eksozomlara nüfuz eder ve proteinleri ve nükleik asitleri çapraz bağlar. Bu adım, eksozomların morfolojisini korumak için hayati önem taşır.
Şimdi, eksozom süspansiyonunu önceden hazırlanmış ızgaraya yükleyin ve adsorpsiyonun gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edin. Ardından, ızgaranın üzerine ağır bir metal lekesi olan birkaç damla uranil asetat ekleyin. Uranil iyonları, zar proteinlerine ve lipitlere bağlanarak eksozom sınırı etrafında bir tortu oluşturur.
Son olarak, fazla lekeyi çıkarmak için ızgarayı suyla yıkayın. İletim Elektron Mikroskobu veya TEM kullanarak ızgaranın kurumasına ve görüntülenmesine izin verin.
Bir elektron ışını eksozomlara çarptığında, numuneyi çevreleyen leke daha fazla elektron saçar. Eksozomlar daha az elektron yoğun olduğundan, ışının geçmesine izin verir. Bu farklı dağılmış elektronlar, yüksek kontrastlı bir görüntü oluşturmak için görüntüleme sistemi tarafından yakalanır.
Negatif lekeli eksozomlar, etraflarında koyu bir sınır ile daha açık görünür.
Negatif boyama yapmak için, 1 mililitre %2 paraformaldehit ile izolasyonu takiben saflaştırılmış eksozomları 5 dakika boyunca sabitleyin. İnce formvar / karbon film kaplı 200 gözenekli bakır EM ızgaraları 1 dakika boyunca kızdırma deşarjı ile tedavi edin. Ardından, bir ızgaraya 5 ila 7 mikrolitre eksozom süspansiyon çözeltisi yükleyin ve 1 dakika inkübe edin. Eksozom konsantrasyonu çok yüksekse, konsantrasyonu uygun bir seviyeye seyreltin.
Hemen, eksozomları EM ızgarasının yüzeyinde yaklaşık 20 damla filtrelenmiş %1 uranil asetat çözeltisi ile boyayın. Izgaranın kenarını filtre kağıdı ile temas ettirerek fazla uranil asetat çözeltisini ızgaradan çıkarın. Ardından, ızgarayı bir damla su ile hızlıca durulayın.
Izgarayı masanın üzerine yerleştirmek için bir cımbız kullanın ve ızgarayı kısmen bir kültür kabı ile örtün. Izgaranın oda sıcaklığında 10 dakika kurumasını bekleyin ve ardından ızgarayı görüntüleyin veya ileride gözlemlemek için bir elektron mikroskobu ızgara kutusunda saklayın.