$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Ani dondurma, doku örneklerinin hızla ultra soğuk sıcaklıklara dondurulduğu bir tekniktir. Doku içindeki DNA, RNA ve proteinlerin doğal yapısını korumaya yardımcı olur.
Uzuv kasını dondurmak için, bir farenin arka ayağından yeni çıkarılmış kas dokusunu alarak başlayın.
Daha sonra, bir strafor kutuya sıvı nitrojen alın ve oldukça iletken bir sıvı olan izopentan içeren bir kabı sıvı nitrojene daldırın.
Çözelti viskoz hale gelene kadar izopentanı dondurun. Aynı anda, bir mantar parçasının üzerine bir damla sıvı dondurma ortamı uygulayın.
Arka bacak kas dokusunu tendonunu tutarak konumlandırın ve doku parçasını sıvı dondurma ortamına dikey olarak gömün. Bu oryantasyon, kasın enine kesit alanının daha sonra belirlenmesine yardımcı olur.
Mantar parçasını bağlı kas dokusuyla birlikte önceden soğutulmuş izopentan banyosuna kısa bir süre daldırın. Bu, kas dokusunun hızlı ve eşit şekilde donmasına yardımcı olur.
Donma ortamı düşük sıcaklıkta katılaşır ve kas dokusunun etrafında jelatinimsi bir tabaka oluşturarak onu yerinde tutar. İnce dilimlenmiş bölümler elde etmek için kas bloğunu bir kriyo-mikrotom içine yerleştirin.
Kesitleri cam slaytlara yerleştirin ve daha fazla histolojik analiz için daha düşük bir sıcaklıkta saklayın.
Tüm kaslar toplandığında, izopentan içeren 50 mililitrelik plastik bir beherin alt yarısını sıvı nitrojene batırın. İzopentan, beherin içinde görünen düz beyaz laminat astar ile hafifçe viskoz hale geldiğinde, bir ayna üzerine birkaç damla gömme ortamı dökün.
Ardından, tendondan bir kas alın ve taze kasın ucunu dikkatlice gömme ortamının üzerine yerleştirin ve mantara göre dikey olarak tutun. Daha sonra, kası dikey tutarak, aynayı ve bağlı kası, doku tamamen donana kadar 7 ila 15 saniye boyunca izopentan banyosuna batırın. İyi donmuş bir örnek kireçli beyaz görünecektir. Ardından, kası eksi 80 santigrat derecede hemen saklamak için bir numune tüpüne yerleştirin.
Numunelerin RNA'larını ve enzimatik yapısını ve aktivitesini korumak için, kas dokularının ekstraksiyonundan sonra mümkün olan en kısa sürede dondurulması gerekir.
Donmuş kas dokusunu bölümlere ayırmak için önce kriyostat iç haznesinin çalışma sıcaklığını eksi 23 santigrat dereceye ayarlayın. Negatif 80 santigrat derece numunenin birkaç saat çalışma sıcaklığına alışmasına izin verin. Daha sonra, numunenin kasın orta göbek bölgesinde, montaj eksenine dik olarak 8 mikron kalınlığında birden fazla kesit elde edin ve kesitleri kesildikçe oda sıcaklığındaki cam slaytlar üzerinde toplayın. Tüm bölümler toplanana kadar numuneleri kriyostat odasının içinde tutun. Ardından, daha fazla analize kadar numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.