Lamina Propria Mononükleer Hücre İzolasyonu: Murin Kolonundan Mononükleer Hücreler Elde Etmek İçin Silika Bazlı Yoğunluk Gradyanlı Bir Santrifüj Tekniği

Bağırsak epitelinin altında bulunan bağırsak lamina propriası, fibroblastlar, lenfositler ve monositler dahil olmak üzere mononükleer hücreler gibi çeşitli hücre dizilerini içeren yoğun bir kollajen lifleri ağı ile birlikte gevşek bağ dokusundan oluşur. Bu hücreler homeostazın korunmasında çok önemli bir rol oynar.

Mononükleer hücreleri izole etmek için, fare kolon parçalarını alarak başlayın. Fragmanlara kollajenaz enzimleri içeren bir sindirim tamponu uygulayın. Kollajenaz enzimleri, doku içindeki kollajen liflerini sindirerek hücreleri süspansiyona bırakır.

Süpernatanı toplayın ve sindirilmemiş doku ve kalıntıları gidermek ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süzgeçlerinden süzün. Kollajenaz enzimlerini etkisiz hale getirmek için süzüntüye soğutulmuş bir tampon ekleyin.

Hücreleri ayırmak için santrifüjleyin. Enzimleri içeren süpernatanı atın ve hücre peletini düşük yoğunluklu silika bazlı bir ayırma ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, bir ayırma gradyanı oluşturmak için süspansiyonu yüksek yoğunluklu silika bazlı bir ayırma ortamının üzerine katmanlayın.

Karışımı santrifüjleyin. Mononükleer hücreler çökelir ve yoğunluk gradyan katmanları arasındaki arayüzde beyaz bir tabaka oluşturur. Beyaz arayüz katmanını dikkatlice uygun bir tampon içeren yeni bir tüpe aktarın.

Saflaştırılmış mononükleer hücreler içeren bir pelet elde etmek için santrifüjleyin. Daha fazla aşağı akış analizi için peleti tamponda yeniden süspanse edin.

Başlamak için, yıkanmış kolon parçalarını içeren tüpe 20 mililitre kollajenaz sindirim tamponu ekleyin. Tüpü kapatın ve 37 dakika boyunca 2 x g dönüş hızına sahip 60 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Ajitasyon sırasında doku parçalarının sürekli hareket halinde olduğundan emin olun.

Üç ayrı 15 mililitrelik polipropilen tüpün her birine 5 mililitre %66 silika bazlı yoğunluk ayırma ortamı dökün. Daha sonra, Kollajenaz Sindirimi 1'den sadece süpernatanı toplamak için 25 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Süpernatanı, temiz bir 50 mililitre polipropilen konik tüpe yerleştirilmiş 40 mikrolitre gözenekli filtrasyon kumaş hücre süzgecinden süzün. Kollajenaz sindirim tamponunu söndürmek için tüpü tamamen soğutulmuş kolon tamponu ile doldurun. Sonra, hücreleri döndürün, süpernatanı aspire edin, ve peleti buz üzerinde tutun.

Metin protokolünde belirtildiği gibi Kollajenaz Sindirimi 2'yi gerçekleştirmeye devam edin. Kollajenaz Sindirimi 2 tamamlandıktan sonra, doku parçalarını 18G künt uçlu bir iğne ile tüp ile 10 mililitrelik bir şırınga arasında kuvvetlice ileri geri yıkayın. Bu yıkamayı en az yedi ila sekiz pasaj boyunca tekrarlayın ve hiçbir brüt doku parçası veya kalıntı görünmeyene kadar devam edin.

Daha sonra, doku ayrıştırma süspansiyonunu temiz bir 50 mililitrelik polipropilen tüpe yerleştirilmiş 40 mikrometre gözenekli bir filtrasyon kumaş hücre süzgecinden geçirin. Sindirimi söndürmek için tüpü soğutulmuş kolon tamponu ile kenara kadar doldurun ve 800 x g'da ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı vakum aspirasyonu yoluyla atın ve yeniden süspanse edilmiş peleti Kollajenaz Sindirimi 1'den karşılık gelen tüpüne çekin. Bundan sonra, her peleti kolon başına 24 mililitre %44 silika bazlı yoğunluk ayırma ortamında yeniden süspanse edin. Bu ortamın 8 mililitresini %66 silika bazlı yoğunluk ayırma ortamı içeren üç tüpün her birine yavaşça katmanlamak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Santrifüj kovaları içindeki tüpleri bir tartı veya terazi kullanarak dikkatli bir şekilde dengeleyin. 859 x g'da ve 20 santigrat derecede 20 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Gradyan arayüzündeki hücreleri bozmamaya dikkat ederek, tüpleri çıkarmadan önce rotorların tamamen dinlenmesine izin verin.

Tipik olarak 1-2 milimetre kalınlığında beyaz bir bandın bulunduğu 5 mililitre işaretinin yakınındaki gradyan arayüzünü görselleştirin. Pipetin arayüze daha kolay erişmesini sağlamak için gradyanın üst 7 mililitresini vakumlayın, aspire edin ve atın. Sürekli manuel emme ve sabit dönen bilek hareketi kullanarak, hücrelerin arayüz katmanını toplayın. İki gradyan arasındaki arayüz net ve kırılabilir olana kadar toplayın ve arayüzü yeni bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın.