Mide Fundik Bezleri İzolasyonu: Fon Bezlerini İnsan Mide Dokusundan İzole Etmek İçin Bir Yöntem

İnsanlarda fundus, midenin en üst kısmıdır. Fundik epitel, sindirime yardımcı olan mide suyu salgılayan çok sayıda mide bezinden oluşur.

Mide fundik bezlerini izole etmek için, bir beherde insan fundik dokusu alarak başlayın. Behere uygun bir tampon ekleyin ve fundik dokuyu kuvvetlice yıkayın. Yıkama, kirletici kalıntıları ve kanı fundik dokudan uzaklaştırır.

Temiz dokuyu bir Petri plakasına aktarın. Steril gazlı bez kullanarak, koruyucu mukoza tabakasını silin, böylece alttaki epitel tabakası açığa çıkar. Forseps kullanarak, en üst epitel tabakasını dokudan kuvvetlice kazıyın.

Kazınmış epiteli başka bir Petri plakasına aktarın ve daha küçük parçalar halinde kıyın. Kıyılmış parçaları, kollajenaz enzimleri ile desteklenmiş bir tampon içeren bir şişeye ekleyin. Topaklanmayı önlemek için sürekli çalkalama ile istenen sıcaklıkta inkübe edin.

Kollajenaz, epitel tabakasında bulunan hücre dışı matriks proteinlerini sindirerek ayrışmış fundik bezleri süspansiyona bırakır. Ayrılmamış topakları çıkarmak için süspansiyonu yeni bir tüpe süzün.

Bezleri çökeltmek için glandüler filtratı buz üzerinde rahatsız etmeyin. Süpernatan içeren hücre kalıntılarını atın ve glandüler tortuyu yeni bir tamponda yeniden süspanse edin. Glandüler peleti santrifüjleyin ve daha fazla kullanılana kadar saklayın.

Başlamak için, hazırlanan dokuyu kalsiyum / magnezyum içermeyen DPBS ile doldurulmuş büyük bir plastik kapta toplayın. Plastik kabı kullanana kadar buz üzerinde bırakın. Daha sonra, forseps yardımıyla dokuyu 100 mililitre kalsiyum / magnezyum içermeyen DPBS içeren steril bir beherde yaklaşık 30 saniye kuvvetlice yıkayın. Ardından, mukus tabakasını epitelden silmek için steril bir gazlı bez kullanın.

Ardından, dokunun kas tabakasını sıkıca tutmak için büyük forseps kullanın. Ardından, büyük kavisli hemostatik forseps kullanın ve epiteli kuvvetle kazıyın. Kazınmış epiteli steril bir polistiren Petri kabında saklayın. Doku sindirimini optimize etmek için epitel dokusunu parçalara ayırın. Ardından, dokuyu antibiyotiklerle desteklenmiş kalsiyum / magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın.

Kanı çıkarmak için birkaç kez yıkayın. Yıkamayı bir atık kabına atın. Daha sonra, yıkanmış epitel parçalarını 25 mililitrelik bir karıştırma çubuğu ve önceden ısıtılmış inkübasyon ortamı ile 125 mililitrelik cam yuvarlak tabanlı bir şişede toplayın. Doku parçalarını topladıktan sonra, yuvarlak tabanlı şişeyi kauçuk bir septa ile kapatın. Ardından, septaya 20 G'lik bir omurga iğnesi yerleştirin. Septayı lastik hortumlu bir oksijen tankına bağlayın.

Yırtılmasını önlemek için septaya 10 ila 15 çıkış iğnesi yerleştirin ve ardından kurulumu bir halka standına sabitlemek için kelepçeler kullanın. Ardından, oksijen çıkışını düşük konuma getirin. Bundan sonra, su banyosunu 30 ila 45 dakika boyunca bir karıştırma plakası üzerinde 37 santigrat derecede kalibre edin. Kalibre edildikten sonra kurulumu su banyosuna yerleştirin. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, ayrışmış bezleri kontrol edin.

İstenilen inkübasyon süresinden sonra, serolojik bir pipet kullanarak inkübasyon ortamına 50 mililitre önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ekleyin. Daha sonra, steril bir gazlı bezden elde edilen bez karışımını dört adet 50 mililitrelik konik tüpte süzün. Ardından, süzüntüyü buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Bu, bezin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verecektir. Bez süspansiyonunun üstünden 40 mililitre süpernatanı atmak için serolojik bir pipet kullanın.

Bez karışımının kalan 10 mililitresini, antibiyotiklerle takviye edilmiş 10 mililitre DPBS'de yeniden süspanse edin. Ardından, tüm karışımı 5 mililitrelik hücre kültürü test tüplerine dağıtın. Tüpleri 65 x g'da 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice çıkarın.