JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:26 dk. • April 30th, 2023
Bir hücredeki belirli bir RNA dizisini tespit etmek için, bir cam slayt üzerinde bir doku kesiti alarak başlayın. Doku bölümünü, hedef RNA problarını içeren uygun bir hibridizasyon tamponu ile kaplayın.
Bu problar, bir ucunda hedef tanıma kısmı ve diğer ucunda bir kuyruk dizisi olan Z şeklindeki RNA molekülleridir. Bir ara kol bu iki ucu birbirine bağlar.
Şimdi, slaydı bir hibridizasyon fırınında optimum sıcaklıkta inkübe edin. Z şeklindeki RNA probları hücreye girer ve çiftler halinde karşılık gelen hedef mRNA dizisi ile hibritleşir.
Slaytı fırından çıkarın. Bağlanmamış probları ve fazla hibridizasyon tamponunu çıkarmak için sürgüyü bir yıkama solüsyonuna daldırın.
Daha sonra, bir ön amplifikatör çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Ön amplifikatör molekülü, iki bitişik Z probunun kuyruk dizisine bağlanır. Bu molekül tek bir Z probuna bağlanmaz ve özgüllüğü sağlar.
Ardından, amplifikatör reaktif karışımını ekleyin ve inkübe edin. Çoklu amplifikatör molekülleri, tek ön amplifikatör dizisine hibritleşir.
Son olarak, hücrede belirli bir RNA dizisinin varlığını tespit etmek için doku bölümünü istenen etiketleme probları ile etiketleyin.
Hibridizasyonu başlatmak için, fazla sıvıyı çıkarmak ve bunları tekrar sürgülü rafa yerleştirmek için slaytlara dokunun ve hafifçe vurun. Önceden ısıtılmış HPV probunu fırından çıkarın ve her bölümü tamamen kaplayacak şekilde yaklaşık dört damla ekleyin. Tepsiyi bir kapakla kapatın ve 40 santigrat derecede 2 saat fırına koyun. Kuluçka işlemini tamamladıktan sonra tepsiyi fırından çıkarın ve sürgülü rafı çıkarın.
Her seferinde bir slayt, fazla sıvıyı hızlı bir şekilde çıkarın ve slaytı 1x yıkama tamponu ile doldurulmuş bir boyama kabına batırılmış bir sürgülü rafa yerleştirin, slaytları oda sıcaklığında sürekli çalkalama ile 2 dakika yıkayın ve taze 1x yıkama tamponu ile tekrarlayın. Slaytlardaki fazla sıvıyı çıkarmak için dokunun ve hafifçe vurun ve bunları tekrar sürgülü rafa yerleştirin. Her bölümü tamamen kaplamak için bölüm başına yaklaşık dört damla oda sıcaklığında AMP1 ekleyin. Tepsiyi bir kapakla kapatın ve 40 santigrat derecede 30 dakika fırına koyun.
Tepsiyi fırından çıkardıktan sonra sürgülü rafı çıkarın. Her seferinde bir slayt çalışarak, fazla sıvıyı hızlı bir şekilde çıkarın ve slaytı 1x yıkama tamponu ile doldurulmuş bir boyama kabına batırılmış sürgülü rafa yerleştirin, oda sıcaklığında sürekli çalkalama ile 2 dakika yıkayın ve taze 1x yıkama tamponu ile tekrarlayın.