JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 2:42 dk. • April 30th, 2023
RNA hibridizasyonu sırasında kromojenik sinyalleri tespit etmek için, bir cam slayt üzerinde bir doku kesiti alarak başlayın. Bu bölüm, yaban turpu peroksidaz işaretli RNA probu ile önceden hibritlenmiş hedef RNA'yı içerir.
Doku bölümünün üzerine birkaç damla diaminobenzidin veya bir tespit substratı olan DAB damlatın ve inkübe edin.
DAB hücreye girer ve yaban turpu peroksidaz enzimi onu kahverengi bir çökelti oluşturmak üzere oksitler. Bu reaksiyon, hücredeki belirli RNA dizilerine kahverengi bir renk verir. Hedef RNA içermeyen hücreler peroksidaz aktivitesine sahip olmayacak ve boyanmadan kalacaktır.
Ardından, doku bölümünü hematoksilen ile boyayın. Hematoksilen DNA'ya bağlanır ve doku bölümüne mor bir leke verir.
Doku bölümüne amonyak suyu uygulayın - mavilik bir çözelti. Mor lekenin yoğunluğunu azaltarak hücrelerin mavi görünmesini sağlar. Bu adım, hücrelerin içindeki kahverengi lekelerin net bir şekilde görselleştirilmesi için gereklidir.
Şimdi, doku bölümünü artan etanol konsantrasyonlarına daldırın ve ardından organik bir çözücü olan ksilen ile muamele edin. Bu adımlar, daha iyi görüntüler elde etmek için doku bölümünü kurutur.
Son olarak, sürgüyü bir montaj solüsyonu ve bir lamel ile kapatın ve ışık mikroskobu altında görselleştirin. Hücreler, hedef RNA'nın varlığını gösteren noktasal kahverengi noktalar sergiler.
Bölüm ve girdap başına yaklaşık 120 mikrolitre DAB substratı yapmak için her bir DAB-A ve DAB-B çözeltisinden aynı sayıda damlayı uygun boyutta bir tüpe dağıtın. Sürgülü raftan her slaytı teker teker alın ve fazla sıvıyı çıkarmak için hafifçe vurun ve hafifçe vurun ve tekrar sürgülü rafa yerleştirin. Her doku bölümüne yaklaşık 120 mikrolitre DAB karışımı pipetleyin ve bölümlerin kapalı olduğundan emin olun. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve karşı boyama işlemine devam edin.
Cam çıta başına bir damla montaj ortamı yerleştirin ve ardından çıtayı slaytların üzerine yerleştirin ve kurumaya bırakın. Birkaç saat sonra, el yazmasında anlatıldığı gibi bir optik mikroskop kullanarak değerlendirmeye devam edin.