JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 2:59 dk. • April 30th, 2023
Sferoidler, in vivo tümör mikro çevresini taklit eden ve tümör ilerlemesini incelemeye yardımcı olan üç boyutlu in vitro küresel hücresel agregatlardır. Bu sferoidleri gömerek korumak için, istenen bir tamponda sferoidler içeren steril bir tüp alarak başlayın.
Sferoidleri paraformaldehit ile tedavi edin. Paraformaldehit, hücresel proteinleri çapraz bağlayarak hücre yapısının stabilizasyonu ve korunması ile sonuçlanır. Sferoidleri santrifüjleyin ve paraformaldehit içeren süpernatanı çıkarın. Küresel peleti tamponda yeniden askıya alın.
Daha sonra, istenen konsantrasyonda erimiş agaroz jel çözeltisi hazırlayın. Mikroskop lamı üzerine bir agaroz jel damlası yapın. Agarozun katılaşmasını önlemek için sürgüyü bir ısıtma bloğu üzerinde tutun.
Geniş delikli bir ucu olan bir mikropipet kullanarak, sferoidleri tüpten toplayın. Mikroskop lamına dokunmadan sferoidleri agaroz jel damlasının ortasına dikkatlice pipetleyin. Daha sonra, ECM'nin katılaşmasına ve sferoidleri içinde tutmasına izin vermek için slaytı uygun bir sıcaklıkta inkübe edin.
Mikroskop lamından yarı katı damlayı yavaşça bir doku kasetine aktarın. Gömülü sferoidleri daha sonraki aşağı akış analizine kadar etanolde saklayın.
Başlamak için, sferoidleri metin protokolünde belirtildiği gibi birinci gün bir çeker ocakta sabitleyin. İkinci günde, agaroz jeli ısıtmak için bir mikrodalga fırında su dolu bir behere koyun ve jeli ihtiyaç duyulana kadar 60 santigrat dereceye ayarlanmış bir tezgah üstü ısıtma plakasında sıcak tutun.
Yıkama başına 1 mililitre buz gibi 1X PBS kullanarak sferoidleri çeker ocakta iki kez yıkayın. Ardından, PBS'nin çoğunu aspire edin. Daha büyük bir deliğe sahip daha sivri bir uç elde etmek için eğimli bir şekilde keserek 20 mikrolitrelik bir pipet ucu hazırlayın.
Bundan sonra, bir mikroskop lamı üzerine bir agaroz jel damlası yapın. Agarozun katılaşmasını önlemek için sürgüyü ılık bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Modifiye edilmiş pipet ucunu kullanarak, 15 ila 20 mikrolitrelik bir hacimde mümkün olduğunca çok sayıda sferoid yakalayın.
Sferoidleri agaroz jel damlasının ortasına dikkatlice enjekte edin ve mikroskop lamına dokunmadığınızdan emin olun. Agaroz jelinin sertleşmesini sağlamak için oda sıcaklığında veya 4 derecede 5 ila 10 dakika inkübe edin. Jel damlası biraz katılaştığında ancak hala oldukça yumuşak olduğunda, mikroskop slaytından plastik bir doku kasetine dikkatlice itmek için bir neşter kullanın. Doku kasetini etanol ile doldurulmuş bir behere aktarın ve oda sıcaklığında saklayın.