Fare Modelinden Hücre Dışı Matriks Üretimi: Murin Dilinden Decellularize Dil Hücre Dışı Matriks Hazırlamak İçin Etkili Bir Prosedür

Hücre dışı matris veya ECM - doku ortamının hücresel olmayan bileşeni - hücreler tarafından salgılanan karmaşık bir yapısal ve düzenleyici proteinler ve polisakkaritler ağından oluşur. ECM, hücrelere yapısal ve biyokimyasal destek sağlar ve büyümelerini düzenler.

Dil hücre dışı matrisini hazırlamak için, yeni hasat edilmiş bir fare dili alarak başlayın. Lipid tabakasını çıkarmak için etanol ile yıkayın.

Ardından, alternatif dondurma ve çözülme döngülerine tabi tutun. Donma, hücre içi buz kristali oluşumunu teşvik ederken, çözülme buz kristallerini eriterek hücre zarının bozulmasına neden olur.

Şimdi, bakteri üremesini engellemek için dili bir antibiyotik solüsyonunda askıya alın. Daha sonra, organı hipertonik bir tuzlu su çözeltisi ile tedavi edin. Yüksek bir çözünen konsantrasyonunun varlığında, hücrelerden su akar ve küçülmelerine neden olur. Bu adım, hücresel ölüme ve hücre dışı matristen ayrılmaya yardımcı olur.

Dili iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içinde inkübe edin. Yüzey aktif madde, hücresel ve nükleer zarları tamamen çözündürerek hücre içi içeriğin çözeltiye salınmasını kolaylaştırır.

Son olarak, dili kalsiyum ve magnezyum iyonları içeren bir çözelti içinde askıya alın, ardından nükleaz tedavisi uygulayın. Kalsiyum ve magnezyum iyonları, çözeltideki serbest nükleik asitleri parçalamak için nükleazların aktivitesini arttırır.

Hücresizleştirilmiş dil dokusunu daha sonraki işlemlere kadar uygun bir tamponda saklayın.

Dilleri metin protokolüne göre ötenazi uygulanmış farelerden izole ettikten sonra, dokuyu 3 dakika boyunca% 75 etanole batırın. Daha sonra, her dili 1 mililitre 10 milimolar steril PBS ile 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre lizizini gerçekleştirmek için dilleri eksi 80 santigrat derecede 1 saat dondurun. Daha sonra dokuyu oda sıcaklığında 45 dakika çözdürün. Donma-çözülme işlemini iki kez daha tekrarlayın.

Daha sonra,% 75 etanol içeren 3,5 santimetre veya 6 santimetrelik bir kültür kabında, her bir dili bir cerrahi dikiş parçasına yüklemek için cerrahi bir iğne kullanın ve küçük bir steril kalay folyo parçası ile dikişin ucunu sarın. 3,5 santimetre veya 6 santimetrelik bir kültür kabında, her dili 30 saniye boyunca durulamak için 3 mililitre PBS kullanın. Daha sonra, geniş ağızlı bir şişede, 250 mililitre steril ultra saf suda mililitre ampisilin başına 90 mikrogram hazırlayın ve bir karıştırma çubuğu ekleyin.

Alttan yaklaşık 2 santimetre uzakta olana kadar şişeye 5 dil indirin ve dikişin bir kısmı şişenin dışında kalacak şekilde kapağı sıkın. Şişeyi 12 saat boyunca manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. Daha sonra, inkübasyondan sonra, steril 1 molar sodyum klorür içinde mililitre ampisilin başına 250 mililitre 90 mikrogram hazırlayın. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye aktarın ve kapağı vidalayın. Şişeyi 24 saat boyunca manyetik karıştırıcıya yerleştirin.

Hücre lizizini gerçekleştirmek için, PBS'de 250 mililitre steril% 2 Triton X-100 içinde mililitre ampisilin başına 90 mikrogram hazırlayın. Dilleri ve karıştırma çubuğunu şişeye aktarın ve kapağı sıkın. Ardından şişeyi 48 saat karıştırın. Ampisilin ile kalsiyum klorür ve magnezyum klorür hazırladıktan sonra, dokuyu ve karıştırma çubuğunu şişeye taşıyın ve şişeyi 24 saat boyunca karıştırın.

Her dil örneği için bir mikrosantrifüj tüpünde HBSS'de 1 mililitre 300 mikromolar DNaz hazırlayın. Dilleri, aynı dikiş kısmı dışarıda asılı olacak şekilde tüplere aktarın. Ardından, dokuyu 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri ampisilin içeren geniş ağızlı bir steril PBS şişesine geri aktarın ve 24 saat boyunca karıştırıcıya yerleştirin. İnkübasyonun ardından, hazırlanan dil hücre dışı matrisi veya TEM'i kullanılana kadar steril PBS'de 4 santigrat derecede saklayın.