ECM Süspansiyon Hazırlığı: Doku Kaynaklı Hücre Dışı Matriksten Homojen Süspansiyon Elde Etme Tekniği
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:16 dk. • April 30th, 2023
Dokularda karmaşık bir destek ağı olan hücre dışı matriks veya ECM, proteoglikanlar ve proteinlerden oluşur.
Homojenize ECM elde etmek için, bir tüpte ölçülen miktarda hücreden arındırılmış ECM tozu alarak başlayın. Şimdi, bir ECM süspansiyonu oluşturmak için tüpe asitleştirilmiş bir tampon ekleyin.
Eşzamanlı olarak, başka bir tüpte, aynı asitleştirilmiş tampon içinde bir glikolitik enzim olan alfa-amilazı çözün. Bu tamponun asidik pH'ı, alfa-amilaz enziminin optimal aktivitesini kolaylaştırır.
Daha sonra, ECM süspansiyonu içeren tüpü alfa-amilaz enzim çözeltisi ile destekleyin. Tüpü sürekli çalkalama ile inkübe edin. Alfa-amilaz, proteoglikanlarda bulunan glikanları - karbonhidrat kısımlarını - hidrolize eder.
Protein açısından zengin ECM fraksiyonunu peletlemek için santrifüjleyin, sindirilmiş glikanları ve harcanan enzimleri süpernatantta bırakın. Süpernatanı atın.
Peleti sodyum klorür çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Klorür iyonları, proteinleri ECM peletinden süspansiyona çıkarır. Sodyum klorür içeren süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Ardından, protein içeren ECM peletine asetik asit ekleyin. Asetik asit, ECM protein agregatlarını daha da çözündürür ve bunları süspans
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin