JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:13 dk. • April 30th, 2023
Mikro taşıyıcılar, hücre bağlanması ve büyümesi için geniş bir yüzey sağlayan birbirine bağlı gözeneklere sahip mikron boyutunda küresel destek matrisleridir.
Hücre dışı matris veya ECM'den türetilmiş mikro taşıyıcılar üretmek için, ince toz haline getirilmiş ECM'nin düzgün bir süspansiyonu ile başlayın. Süspansiyonu bir infüzyon setine bağlı bir şırıngaya yükleyin. Şırıngayı bir şırınga pompasına sabitleyin. İğneyi kriyojenik bir şişe üzerine uygun bir mesafede dikey olarak yerleştirin.
Şimdi, iğneyi yüksek voltajlı bir güç kaynağının pozitif terminaline bağlayın. Şişenin kenarına katlanmış bir alüminyum folyo şerit takın ve devreyi tamamlamak için topraklama terminaline bağlayın.
Ardından, alüminyum şeridin iç ucu suya batırılmış olarak şişeye sıvı nitrojen doldurun. İstenilen voltajı uygulayın ve elektro püskürtmeyi başlatmak için şırınga pompasını uygun bir akış hızına ayarlayın. İletken ECM süspansiyonu iğne ucundan çıkarken, şekli elektrik alanı ve yüzey geriliminin etkisi altında deforme olur ve sivri bir sıvı koni oluşturur.
Voltaj artışlarıyla, süspansiyon dışarı püskürtülür. Bu sonunda yüklü daha küçük damlacıklara ayrılır ve sıvı nitrojen banyosuna düşer. Sıvı nitrojen, mikro damlacıkları anında dondurur ve içindeki çözücü parçacıklarını kristalleştirir.
Donmuş mikro damlacıkları yeni bir tüpe aktarın. Numuneyi liyofilize edin. Bu adım, donmuş çözücü parçacıklarının numuneden uzaklaştırılmasına yardımcı olur ve bunların yerine gözenekler oluşturur. Daha sonraki uygulamalar için gözenekli mikro taşıyıcıların kuru tozunu saklayın.
Cryomilled ECM süspansiyonunu gece boyunca 100 rpm'de sürekli çalkalama ile inkübe edin. 3 mililitre ECM süspansiyonunu 3 mililitrelik Luer-Lock şırıngaya yükleyin ve şırınganın deliğine kanatlı bir infüzyon seti takın. Şırıngayı şırınga pompasının içine sabitleyin. Ardından, iğneyi bir otoklav standına sabitleyin ve iğne ucunu düşük formlu bir Dewar şişesinin üstünden 4 ila 6 santimetre mesafede dikey olarak konumlandırın.
Ardından, iğnenin ucuna bir timsah klipsi elektrodu takın ve ayrıca timsah klipsinin yüksek voltajlı güç kaynağının pozitif terminaline bağlı olduğundan emin olun. Alüminyum folyo şeridini termosun kenarına katlayın. Ardından, folyonun dış kenarına ikinci bir timsah klipsi elektrodu takın. Güç kaynağının toprak kaynağı terminaline bağlayın.
Dewar şişesini, folyonun dörtte üçü suya batırılacak şekilde üstten yaklaşık 1 santimetreye kadar sıvı nitrojen ile doldurun. Ardından, şırınga pompasını saatte 30 mililitre infüzyon hızına ayarlayın ve numuneleri metin protokolüne göre elektropüskürtün. İnfüzyon tamamlandıktan sonra, Dewar'dan fazla sıvı nitrojeni dikkatlice boşaltın ve mikro taşıyıcıyı donmuş kalmalarını sağlamak için yaklaşık 25 mililitre sıvı nitrojen içinde asılı bırakın.
Sıvı nitrojen içeren mikro taşıyıcıları tek bir yumuşak hareketle dökerek hemen 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, Dewar'da kalan donmuş mikro taşıyıcıları toplamak için bir kepçe kullanın. Bunları santrifüj tüpüne ekleyin. Liyofilizasyona hazırlanmak için santrifüj tüpünü küçük deliklerle delikli alüminyum folyo ile örtün. Kapalı santrifüj tüplerini bir liyofilizatör şişesine yerleştirin. Ardından, şişeyi hemen liyofilizatöre bağlayın ve numuneleri gece boyunca kurutun.