JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:22 dk • April 30th, 2023
Bir tümör, yan popülasyon olarak bilinen kök benzeri hücrelerin küçük bir kısmını içerir. Bu hücreler kemorezenttir, bu da onları kanserin nüksetmesinden sorumlu kılar.
Kanser hücrelerinin yan popülasyonunu izole etmek için, kanser hücresi süspansiyonu içeren şişeye bir floresan boya çözeltisi olan Hoechst ekleyerek başlayın. Normal kanser hücrelerinin içinde, Hoechst molekülleri çekirdeğe girer ve DNA'daki AT açısından zengin bölgeye bağlanır ve bu hücrelerde yüksek floresansa yol açar.
Buna karşılık, yan popülasyon yüksek konsantrasyonda ABC taşıyıcıları içerir - boya moleküllerini hücreden hızla uzaklaştıran akış pompaları. Boya moleküllerinin bu aktif akışı, yan popülasyonun düşük yoğunlukta floresan olmasını sağlar.
Şimdi, Hoechst ile tedavi edilen kanser hücrelerinin başka bir şişesini alın ve buna Verapamil ekleyin. Bu şişe, Verapamil ABC taşıyıcılarını bloke ettiği için bir kontrol görevi görür. Bu adım, Hoechst akışında bir azalmaya neden olur ve boyayı yan popülasyon hücrelerinin içinde tutar.
Daha sonra, propidyum iyodür kullanarak her iki şişedeki hücreleri karşı boyayın. Propidyum iyodür sadece ölü hücrelerin çekirdeğine girer ve DNA bazları arasında ara araya girer. Bu, ölü hücrelerde yüksek floresansa yol açar.
Son olarak, floresanla aktive edilen bir hücre sıralayıcı veya FACS kullanarak hücreleri sıralayın. FACS, yüksek floresanlı, Hoechst tutucu tümör hücrelerini ve ölü hücreleri düşük floresan yan popülasyonlu hücrelerden ayırır.
Hoechst boya akışı testi ile kanser kök benzeri hücrelerin bir yan popülasyonunu seçmek için, önce bir konik tüpü "Hoechst" ve bir "Hoechst ve Verapamil" olarak etiketleyin. Daha sonra, bir HNSCC hücre kültürünü steril PBS ile yıkayın, ardından 1 mililitre tripsin-EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede 3 dakika sonra, taze hücre kültürü ortamı ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri sayın. Kültürü, tam ebeveyn hücre hattı ortamında mililitre başına 1 kez 10 ila yedinci hücreye seyreltin.
Daha sonra "Hoechst ve Verapamil" tüpüne 100 mikrolitre ve "Hoechst" tüpüne 4 mililitre hücre ekleyin. Daha sonra, 10 mikrolitre 5 milimolar Verapamil hidroklorür çözeltisini "Hoechst ve Verapamil" örneğine yavaşça karıştırın, ardından her iki tüpe altıncı hücrelere 1 çarpı 10 ila 5 mikrolitre Hoechst karıştırın. Daha sonra numuneleri alüminyum folyo ile örtün ve 37 santigrat dereceye yerleştirin. Her 15 dakikada bir hafifçe karıştırarak 90 dakika sonra, tüpleri santrifüjleyin ve peletleri 2 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.
İkinci bir santrifüjlemeden sonra, PBS'de 500 mikrolitre propidyum iyodür içinde "Hoechst ve Verapamil" peletini ve 4 mililitrede "Hoechst" peletini yeniden süspanse edin. Şimdi, herhangi bir agregayı çıkarmak için numuneleri 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden FACS tüplerine süzün ve numuneleri ışıktan korunan buz üzerine yerleştirin. Ardından, "Hoechst" örneğini akış sitometresine yükleyin ve akış sitometresi yazılımında "Global Çalışma Sayfası" penceresini açın. Global çalışma sayfasında bir grafik oluşturmak için "Nokta Grafiği"ne tıklayın ve ileri ve yan dağılım parametrelerini seçmek için sağ tıklayın.
Aynı şekilde bir yan dağılım yüksekliği nokta grafiği ile geniş bir yan dağılım oluşturun ve ardından tek hücreleri seçmek ve çiftleri ayırt etmek için ikinci grafikte bir P1 bölgesi oluşturmak için "Çokgen Kapısı"na tıklayın. Ardından, mavi bir Hoechst alanı nokta grafiği ile kırmızı bir Hoechst alanı oluşturun ve P1 popülasyonunu vurgulamak için hücrelere sağ tıklayın. Ardından, ana hücre popülasyonunun solunda bir yan kol olarak görünen hücrelerin negatif Hoechst boya tarafı popülasyonunu seçmek için bir P2 bölgesi oluşturun ve "Hoechst" örnek olaylarından 10.000 tanesini toplayın.
Yan popülasyonu temsil eden P2 kapısının doğru konumlandırıldığını doğrulamak için 10.000 "Hoechst ve Verapamil" örnek olayı da toplayın. Yan popülasyon ortadan kalkmalıdır. Daha sonra, Hoechst boya negatif hücrelerinin yan popülasyonunu, 1 mililitre tam kanser kök benzeri hücre ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe sıralayın. Sıralamanın sonunda, hücreleri döndürün ve yan popülasyon peletini 1 mililitre taze tam kanser kök benzeri hücre ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri sayın ve uygun sayıda yeni bir hücre kültürü şişesine tohumlayın.