DAPI Boyama Kullanılarak Hücre Ölümü Taraması: Kanserli Hücre Hatlarında IR ile İndüklenen Klonojenik Hücre Ölümünün Hızlı Taraması İçin Bir Yöntem

X ışınları gibi iyonlaştırıcı radyasyonlara maruz kalmak DNA hasarına neden olabilir ve sonunda hücre ölümüne yol açabilir. İyonlaştırıcı radyasyonların hücre ölüm profilleri üzerindeki etkisini taramak için, bir lamel yüzeyine yerleştirilmiş yapışık kanser hücrelerini içeren bir kültür kabı alarak başlayın.

Kültür kabını istenen süre boyunca X-ışınları ile ışınlayın. Bu tedavi hücrelerin içinde DNA hasarına neden olur. Daha sonra, harcanan ortamı kültür kabından aspire edin ve uygun bir fiksatif ekleyin. Bu çözelti hücrelere nüfuz eder ve sonraki boyama adımları sırasında hücresel bileşenleri yerine kilitler.

Fiksatif çözeltiyi atın. X-ışını ile muamele edilmiş hücreleri içeren lameli kültür kabından çıkarın. Lameli çevirin ve hücreler DAPI ile doğrudan temas halinde olacak şekilde üzerinde bir damla DAPI lekesi taşıyan bir cam sürgünün yüzeyine yerleştirin.

DAPI molekülleri çekirdeğe girer ve DNA'nın AT açısından zengin bölgelerine bağlanır. Şimdi, hücreleri bir floresan mikroskobu altında görselleştirin. Çekirdekler mavi görünür ve farklı morfolojiler sergiler.

Yoğunlaştırılmış ve parçalanmış çekirdekleri gösteren hücreler, apoptozun, programlanmış hücre ölümünün göstergesidir. Çok loblu çekirdekler sergileyen diğerleri, hücrelerin mitotik felaket yaşadığını temsil eder. Birden fazla parlak nokta gösteren düzleştirilmiş çekirdeğe sahip olanlar, yaşlanma geçiren hücreleri düşündürür.

Hücreleri inkübatörden alın ve kültür ortamını kültür kabından aspire edin. 1.000 mikrolitrelik bir mikropipet ucunun ucunu makas kullanarak uçtan yaklaşık 5 milimetre kesin ve kültür kabına 1 mililitre sabitleme solüsyonu eklemek için kullanın.

Hücrelere verilen zararı en aza indirmek için sabitleme solüsyonunu kültür kabının duvarları boyunca uygulayın. Ardından, bu kültür kabını kare bir kültür kabına aktarın ve sabitleme solüsyonunu lamel üzerine eşit şekilde dağıtmak için hafifçe sallayın. Bundan sonra, çanağı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Sabitleme çözeltisini çanaktan aspire edin. Şimdi, yemeğin duvarları boyunca 2 mililitre PBS ekleyin ve ardından PBS'yi aspire edin. DAPI boyamaya hazırlanmak için, bir cam slayt üzerine 5 mikrolitre DAPI boyama reaktifi ekleyin. Ardından, lameli bir neşter kullanarak tabaktan çıkarın ve lamelin kenarına bir kağıt havluyla dokunarak lamel üzerindeki fazla PBS'yi boşaltın.

Şimdi, hücrelerin DAPI boyama reaktifine maruz kalması için lamel cam slayt üzerindeki DAPI boyama reaktifinin damlasına baş aşağı monte edin. Son olarak, lekeli hücreleri bir DAPI filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu altında inceleyin.