Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu prosedürün genel amacı, klonaliteye sahip ve yüksek verimlilikte biyolojik ürünler için üretim hücre hatları geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle konak hücrenin ilgili geni kodlayan DNA ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yüksek üretimli klonların FACTS ile izole edilmesi ve ardından koloni oluşumunun CloneSelect imager ile belgelenmesidir.

Son adım, yüksek verimli klonların taranması ve seçilmesidir. Nihayetinde, ters fazlı HPLC aracılığıyla sürekli ve beslemeli kesikli kültürlerde antikor üretimi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntemin gösterimi kritiktir; çünkü hücre ayıklama ve pcan 80 dgl adımları, bu prosedürlerde karmaşık bir kurulum söz konusu olduğu için öğrenilmesi zor süreçlerdir. Bir laboratuvardan gelen şu bilim insanları; konak hücre etkisinin transfeksiyonu için Jason Sanders, koloni oluşumunun belgelenmesi için hücre ayıklama ve tecan örneklemesi için Russell Kan bu prosedürleri gösterecektir.

Bu prosedüre başlamak için, transfeksiyondan bir gün önce konak hücreleri 15 milliliters büyüme ortamı içeren bir hücre kültür flaskına ekleyin. Hücreleri 37 °C, %7,5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyon komplekslerini hazırlayın; önce 8 µg DNA'yı, steril bir mikro santrifüj tüpünde 800 µL serumsuz büyüme ortamı ile seyrelterek hafifçe karıştırın. Ardından, 40 µL lipidi, bir polistiren tüpte 800 µL serumsuz büyüme ortamı ile seyreltin.

Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş Lipofectamine'e ekleyin. Nazikçe karıştırın ve konak hücreleri transfeksiyona hazırlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücrelerdeki büyüme ortamını uzaklaştırın ve yerine 6.4 milliliters serumsuz büyüme ortamı ekleyin.

Transfeksiyon komplekslerinden 1.6 milliliters flask'a ekleyin. Flask'ı sallayarak nazikçe karıştırın. Hücreleri bir karbondioksit inkübatöründe 37 degrees Celsius'de altı saat boyunca inkübe edin.

Altı saat sonra, erlene sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin ve ertesi güne kadar bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de inkübe edin. Ortamı aspirasyonla uzaklaştırın ve erlene taze büyüme ortamı ekleyin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından hücreleri tekrar bir gece boyunca inkübe edin.

Büyüme ortamını seleksiyon ortamı ile değiştirin. Hücreleri, bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de iki ila üç hafta boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan iki ila üç hafta sonra hücreler, akış sitometrisi ile aktive edilmiş hücre sıralaması (FACS) yoluyla klonlama için hazır hale gelir; flasktan ayrılan hücreleri toplayın ve 4 °C'de, 800 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri %2 sığır serum albüminli seçme ortamında yeniden süspande edin. Ardından floresan işaretli anti-human IgG antikoru ekleyin. 1/20 dilüsyonda ekleme yapıp 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ardından soğuk PBS ile iki kez yıkayıp hücreleri bir polipropilen tüp içerisinde 1xPBS ile yeniden süspande edin.

Boyanmış hücrelere bir örnek bu resimde gösterilmiştir; BD FACS Aria'da aseptik ayırma işlemi için her kuyucuğunda 200 µL seleksiyon ortamı içeren 96 kuyucuklu bir hücre kültürü plağı hazırlayın. Hücrelerin bulunduğu tüpü aseptik olarak yükleyin ve BD FACS Aria'da analiz edin; boyanmış ve boyanmamış hücreler için sonuçları sırasıyla kaydedin.

İstenen floresan boyama profiline sahip tek hücreleri 96 kuyucuklu plakaya ayırmak için kapıları ve ayarları belirleyin; plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde iki hafta boyunca inkübe edin. Ayıklama işleminden sonraki sıfırıncı, üçüncü, yedinci ve 13. günlerde, tek bir hücreden türemiş klonların seçildiğinden emin olmak ve yüksek üretkenliğe sahip klonları tarayıp seçmek için 96 kuyucuklu plaktaki koloni oluşumunu bir klon seçme görüntüleyici ile belgeleyin. İlk olarak, alıcı 96 kuyucuklu analiz plakasındaki örnek konumunu belgeleyin. Ardından, süpernatanstan 20 µL'lik alikotları 96 kuyucuklu analiz plakasının her bir kuyuğuna aktarmak için robotik bir sıvı aktarım sistemi kullanın. Örneklerdeki antikor üretimi bir sandviç yöntemiyle analiz edilir.

Sıvı taşıma sisteminde insan IgG saptama ELI SA şu şekilde gerçekleştirilir. İlk olarak, örnekler ve bir standart, önceden kodlanmış biyokaplamalı anti-insan IgG analiz plaklarına yüklenir. Plakalar oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edilir ve ardından üç kez PBS ile yıkanır.

Ardından, immuno pure keçi anti-human IgG HRP, 1:2000 dilüsyonda plakalara eklenir ve plakalar oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilir. Bir saat sonra plakalar PBS ile üç kez yıkanır ve ardından A BTS substratı eklenir.

Son olarak, plakalar bir plaka okuyucuda, saptama için 405 nanometre absorbans kullanılarak okutulur. Bu otomatik platform kullanılarak, floresan işaretli anti-human IgG ile boyamanın yansıttığı yüzey antikor seviyesinin, hücrenin antikor üretkenliği ile ilişkili olduğu saptanmıştır. Burada, yüksek yüzey antikor ekspresyonuna sahip hücre popülasyonundan üretilen en iyi iki klon için gösterildiği üzere, spesifik üretkenlik günde hücre başına 50 ila 70 pikogram arasında değişmekteydi.

Buna karşılık, düşük yüzey antikor ekspresyonuna sahip hücre popülasyonundan elde edilen en iyi iki klon için antikor üretkenliği günde hücre başına yaklaşık 20 pikogram düzeyindeydi. Ayrıca, FACS sıralaması ile geliştirilen hücre hatları, manuel sınırlayıcı dilüsyon yoluyla klonlananlara göre antikor üretimi açısından daha stabildir. Manuel sınırlayıcı dilüsyonla elde edilen en iyi klon olan klon bir'in spesifik üretkenliği, 80 hücre döngüsü boyunca kültüre edildikten sonra yaklaşık 30 PCD'den yaklaşık 10 PCD'ye düşmüştür.

Öte yandan, FACS sıralamasıyla üretilen klon iki'den elde edilen en iyi alt klon, spesifik üretkenliği en az 100 hücre bölünmesi boyunca yaklaşık 20 PCD seviyesinde tutabilmiştir. Floresan yerinde hibridizasyon ile hücre kromozomundaki transgen entegrasyon bölgesinin belirlenmesi, klon bir'in fenotip A ve fenotip B'den oluşan karma bir popülasyon olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, FACS ile sıralanan klon, hücrelerin %99,5'inin fenotip A olduğu daha homojen bir popülasyon olarak görünmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, terapötik proteinlerin üretimi için üretim hücre hatlarının nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.