Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu prosedürün genel amacı, klonalite ve yüksek üretkenliğe sahip biyolojikler için üretim hücre hatları geliştirmektir. Bu, ilk olarak, ilgilenilen geni kodlayan konakçı hücrenin DNA ile kesilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yüksek verimli klonları gerçeklere göre izole etmek ve ardından klon seçme görüntüleyicisi tarafından koloni oluşumunun belgelenmesidir.

Son adım, yüksek verimli klonları taramak ve seçmektir. Sonuç olarak, ters faz HPLC ile sürekli ve beslenen kesikli kültürlerde antikor üretimini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Video. Bu yöntemin gösterilmesi kritiktir, çünkü gerçek sıralama ve pcan 80 dgl adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü bu prosedürlerde karmaşık bir kurulum söz konusudur, bir laboratuvardan aşağıdaki bilim adamları, konak hücre etkisinin transfeksiyonu için bu prosedürleri gösterecek, Jason Sanders'ı koloni oluşumunun belgelenmesi için ve Russell Kan'ı tecan örneklemesi için sıralayacaktır.

Ve Eliza: Bu işleme başlamak için, transfeksiyondan bir gün önce, konakçı hücreleri bir hücre kültürü şişesinde 15 mililitre büyümeyle tohumlayın. Orta. Ertesi gün hücreleri 37 santigrat derece,% 7.5 karbondioksit inkübatörde inkübe edin, transfeksiyon komplekslerini hazırlayın, önce sekiz mikrogramı seyreltin, DNA'yı steril bir mikro santrifüj tüpünde serumsuz 800 mikrolitre büyüme ortamında nazikçe karıştırın. Daha sonra, 40 mikrolitre dudağı bir polistiren tüpte serum olmadan 800 mikrolitre büyüme ortamında seyreltin.

Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş Lipofektamin içine ekleyin. Yavaşça karıştırın ve konakçı hücreleri transfeksiyona hazırlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Büyüme ortamını hücrelerden çıkarın ve serumsuz 6.4 mililitre büyüme ortamı ile değiştirin.

Şişeye 1.6 mililitre transfeksiyon kompleksi ekleyin. Şişeyi sallayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri altı saat boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.

Altı saat sonra, şişeye sekiz mililitre büyüme ortamı ekleyin ve ertesi gün gece boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Ortamı aspirasyonla çıkarın ve şişeye taze büyüme ortamı ekleyin. Gece boyunca inkübasyondan sonra hücreleri gece boyunca tekrar inkübe edin.

Büyüme ortamını seçimle değiştirin. Orta. Hücreleri iki ila üç hafta boyunca bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfekte edildikten iki ila üç hafta sonra, hücreler akış sitometrisi ile klonlamaya hazır hale getirilir ve yerinden çıkan hücreleri şişeden ayırır ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjler.

% 2 sığır serum albümini ile desteklenmiş hücreleri seçim ortamında yeniden süspanse edin. Ardından floresan etiketli anti-insan IgG antikoru ekleyin. Bir ila 20 seyreltme ekleyin, 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve daha sonra bir polipropilen tüpte bir XPBS'de soğuk PBS yeniden süspansiyon hücreleri ile iki kez yıkayın.

Bu resimde aseptik sıralama için lekeli hücrelerin bir örneği gösterilmektedir: BD faks aryası, her kuyucukta 200 mikrolitre seçim ortamı içeren 96 oyuklu bir hücre kültürü plakası hazırlayın. Tüpü aseptik olarak hücrelerle yükleyin ve BD gerçeklerini analiz edin. Aria, sırasıyla lekeli ve lekesiz hücreler için sonuçları kaydedin.

İstenen floresan boyama profilinin tek hücrelerini 96 Kuyulu plakaya sıralamak için kapıları ve ayarları ayarlayın, plakayı 37 derecelik bir inkübatörde iki hafta boyunca sıfırıncı gün, üçüncü gün, yedinci gün ve 13. günde inkübe edin, gerçek sıralama belgesi koloni oluşumundan sonra 96 kuyulu plakada tek bir hücreden türetilen klonların ekrana seçilmesini sağlamak için görüntüleyiciyi seçin ve yüksek verimli olanı seçin Klon. Alıcı 96 kuyulu tahlil plakasındaki ilk belge numunesi konumu. Daha sonra, 20 mikrolitre süpernatanın alikotlarını 96 kuyulu her bir kuyucuğa aktarmak için robotik bir sıvı işleme sistemi kullanın, numunelerdeki test plakası antikor üretimi bir sandviç ile analiz edilir.

İnsan IgG, sıvı taşıma sisteminde ELI SA'yı aşağıdaki şekilde tespit eder. İlk olarak, numuneler ve bir standart, önceden kodlanmış bio coat anti-insan IgG test plakalarına yüklenir. Plakalar oda sıcaklığında iki saat inkübe edilir, ardından üç PBS yıkaması yapılır.

Sonraki immüno, saf keçi, anti-insan IgG. HRP, plakalara bir ila 2000 seyreltmede eklenir ve plakalar oda sıcaklığında bir saat inkübe edilir. Bir saat sonra, plakalar PBS ile üç kez yıkanır ve ardından A BTS substratı eklenir.

Son olarak, plakalar, algılama için 405 nanometrede absorbans kullanan bir plaka okuyucu üzerinde kırmızıdır. Bu otomatik platform kullanılarak, floresan etiketli anti-insan IgG ile boyama ile yansıtılan yüzey antikor seviyesinin, hücrenin antikor verimliliği ile ilişkili olduğu bulundu. Burada gösterildiği gibi, yüksek yüzey antikor ekspresyonu ile hücre popülasyonundan üretilen ilk iki klon için, spesifik üretkenlik hücre başına günde 50 ila 70 pikogram arasında değişmektedir.

Buna karşılık, antikor üretkenliği, düşük yüzey antikor ekspresyonu olan hücre popülasyonundan üretilen ilk iki klon için hücre başına günde yaklaşık 20 pikogram idi. Ayrıca, olgu sıralama ile geliştirilen hücre hatları, antikor üretimi açısından manuel sınırlayıcı seyreltme yoluyla klonlananlardan daha kararlıdır. Manuel sınırlama seyreltme ile üretilen üst klon klonunun spesifik üretkenliği, 80 hücre ikiye katlaması için kültürlemeden sonra kabaca 30 PCD'den kabaca 10 PCD'ye düştü.

Öte yandan, faks sıralama klon iki tarafından oluşturulan üst alt klon, en az 100 hücre ikiye katlama için spesifik üretkenliği 20 PCD civarında tutabildi. Hücre kromozomundaki transgen entegrasyon bölgesinin floresan in situ hibridizasyon ile tanımlanması, klon birin karışık bir fenotip A popülasyonu olduğunu ve fenotip B.In kontrast olduğunu gösterdi, aslında sıralanan klon, fenotip A hücrelerinin% 99.5'i ile daha homojen bir popülasyon gibi görünüyordu.Bu videoyu izledikten sonra, terapötik proteinlerin korunması için üretim hücre hatlarının nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.