$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Eksozomlar, hücreler tarafından biyosıvılara salgılanan hücre dışı veziküler yapılardır. Biyosıvılardan belirli eksozomları yakalamak için, bir tüpte streptavidin kaplı manyetik boncuklar alarak başlayın.
Bu tüpe, biyotinile edilmiş anti-insan antikorları ekleyin. Antikorlar üzerinde bulunan biyotin, manyetik boncuklarda bulunan streptavidin için yüksek bir afiniteye sahiptir. Bu, antikorların manyetik boncuklarla konjugasyonu ile sonuçlanır.
Daha sonra, antikor etiketli manyetik boncukları içeren tüpe protein açısından zengin bir bloke edici çözelti ekleyin. Bloke edici solüsyondaki proteinler, manyetik boncuklar üzerindeki serbest bölgelere bağlanır ve eksozom bağlanmasının özgüllüğünü arttırır.
Şimdi, tüpü eksozomlar açısından zengin bir örnek biyosıvı ile destekleyin. Tüpü çalkalama ile inkübe edin. Biyoakışkandaki eksozomlar, manyetik boncukların yüzeyine bağlı antikorlara bağlanmalarına yardımcı olan spesifik yüzey reseptörleri gösterir.
Ardından, tüpü manyetik bir alana yerleştirin. Manyetik alanın etkisi altında, eksozoma bağlı manyetik boncuklar tüpün yüzeyine yapışır. Ardından, bir mikropipet kullanarak, kalan biyosıvıyı tüpten aspire edin.
Son olarak, tüpü manyetik alandan çıkarın ve eksozoma bağlı boncukları çıkarmak için uygun bir tampon ekleyin. Bu eksozoma bağlı boncuklar, daha fazla aşağı akış analizi için kullanılabilir.
Streptavidin kaplı manyetik mikropartiküllerin mililitresi başına 10 mikrogram içeren bir stok çözeltisini yeniden süspanse edin ve 5 mikrolitre çözeltiyi 495 mikrolitre PBS içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Boncukları yıkamak için önce tüpü 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden tamponu dikkatlice çıkarın.
Ardından, tüpü manyetik olmayan bir rafa aktarın. Boncukları yıkamak için 500 mikrolitre PBS ve pipet ekleyin. Bunu toplam üç kez yapın. Son yıkamadan sonra, boncukları 490 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve ardından mililitre stok çözeltisi başına 1 miligramdan 5 mikrolitre biyotinile fare anti-insan CD63 antikoru ekleyin.
Çözeltiyi pipetleyerek karıştırın. 5 saniye boyunca 90 derecede karşılıklı dönüş ve 5 saniye boyunca 1 derecede titreşim için bir örnek döndürücü programlayın. Tüpleri döndürücüye yerleştirin ve programı oda sıcaklığında 30 dakika çalıştırın.
Ardından, tüpleri 5 dakika boyunca manyetik rafa aktarın. Boncukları 500 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın ve ardından kazein içeren 490 mikrolitre PBS içinde tekrar süspanse edin. Bir tüpü numune tanımlaması ile etiketleyin ve ardından numuneden 10 mikrolitre ekleyin.
Numuneyi antikor konjuge boncuklarla karıştırmak için birkaç kez pipetleyin. Daha sonra, tüpleri numune döndürücüye aktarın ve aynı programı oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalıştırın. Ardından, mıknatıslanmış rafı kullanarak boncukları 500 mikrolitre 1M Tris-Hidroklorür tamponu ile üç kez yıkayın. Eksozomlar şimdi manyetize boncuklara bağlanmıştır.