Tükürük Bezi Dokusundan Tükürük Kürelerinin Kültürlenmesi: İnsan Tükürük Bezi Kaynaklı Epitel Hücrelerinden Tükürük Küreleri Geliştirmek İçin Bir Yöntem

Tükürükler in vitro, tükürük bezinden türetilen epitel hücrelerinin kendi kendine toplanan kültürleridir. Tükürük kültürlerine başlamak için, insan tükürük bezi dokusunu bir kültür plakasına alarak başlayın.

Makas kullanarak dokuyu ince parçalar halinde kıyın. Daha sonra, bu parçaları kollajenaz ve dispase enzimleri içeren bir ayrışma solüsyonu ile destekleyin ve inkübe edin. Bu enzimler dokuda bulunan hücre dışı matrisi sindirir.

Ayrıca, dokuyu homojenize etmek için ezin. Bu adım, epitel hücrelerini ve eritrositleri çözeltiye bırakır. Ardından, bir hücre süzgeci kullanın ve sindirilmemiş doku parçalarını ve kalıntıları gidermek için doku homojenatını yeni bir konik tüpe süzün. Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve hücre peletini RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Bu tampon, hücre süspansiyonunda bulunan eritrositleri parçalar.

Şimdi, epitel hücrelerini peletlemek için santrifüjleyin. Peletleri uygun bir epitel hücresi büyüme ortamına yeniden süspanse edin. Ek olarak, tükürük kültür plakasını kuyusunu sıvılaştırılmış bir bazal membran matrisi veya BMM ile kaplayarak hazırlayın. Matrisin katılaşmasına izin vermek için inkübe edin.

Son olarak, epitel hücresi süspansiyonunu BMM kaplı oyuklara ekleyin. Büyüme ortamının varlığında, epitel hücreleri BMM tabakasına bağlanır ve küresel tükürüklere çoğalır.

Hastadan çıkarıldıktan iki ila dört saat sonra, bir kültür plakası üzerinde, tükürük bezi dokusunu 1 ila 2 milimetre boyutunda ince parçalar halinde kıymak için otoklav sterilize edilmiş diseksiyon makası ve cerrahi forseps kullanın. Kıyılmış dokuya 6 mililitre dispas / kollajenaz çözeltisi ekleyin. Ardından, 37 santigrat derecede yaklaşık 30 dakika ila bir saat inkübe edin.

5 mililitrelik serolojik pipetle 15 ila 20 kez pipetleyerek dokuyu bozun. 37 santigrat derecede 30 dakika ila bir saat daha inkübe edin. Pipetleme ve inkübasyon adımını iki ila üç kez daha veya doku bir bulamaç gibi görünene ve pipet açıklığından kolayca geçebilene kadar tekrarlayın.

Kuyuları BMM ile kaplamak için, 500 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna gece boyunca çözülmüş 500 mikrolitre BMM'yi yavaşça pipetleyin. BMM'yi kuyucuklara eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça döndürün. Ardından, BMM'nin katılaşmasını sağlamak için kaplamalı plakaları kullanmadan önce en az 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Homojenize doku içeren dispas/kollajenaz solüsyonunu 15 milimetrelik konik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri konik tüpe aktarmak için plakanın duvarını bir kez 6 mililitre DPBS ile yıkayın. Ardından, 70 mikrometrelik bir naylon ağ hücre süzgecinden geçirilerek, sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için homojenatı yeni bir 50 milimetrelik konik tüpe süzün.

Gergin hücreleri 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücre peletini 10 mililitre 1x RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. Ardından, RBC lizis tamponunu nötralize etmek ve tükürük hücrelerinin parçalanmasını en aza indirmek için 20 ila 25 milimetre DPBS ekleyin.

500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Beyaz hücre peleti, tüm RBC'nin tamamen parçalandığını gösterir. Pelet kırmızı renkteyse, RBC lizis tamponu ile işlemi tekrarlayın. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 ila 2 mililitre BEGM içinde yeniden süspanse edin ve ardından yeniden süspanse edilmiş hücreleri BMM kaplı kuyucuklara aktarın.

37 santigrat derecede inkübe edin. BMM'ye kaplandıktan sonra, hücreler iki ila üç günlük bir süre boyunca küresel yapılar veya tükürükler halinde oluşacaktır. Hücreler, BMM bozulmaya başlamadan önce yaklaşık beş ila yedi gün tükürük küresi olarak tutulabilir, bu da hücrelerin plastiğe erişmesine ve yapışmasına ve tek tabaka olarak büyümesine izin verir.