Hücre Dışı DNA Boyama: FFPE Doku Kesitlerinde Hücre Dışı DNA'yı Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Ölmekte olan bir hücre, hücre dışı DNA adı verilen hücrenin dışına bir DNA fraksiyonu salgılar. Hücre dışı DNA'yı boyamak için, bir cam slayt üzerinde formalinle sabitlenmiş parafine gömülü veya FFPE doku kesiti alarak başlayın. Cam sürgüyü istediğiniz süre boyunca ısıtın. Bu, dokunun slayt yüzeyine yapışmasını kolaylaştırır ve çevredeki parafini yumuşatır.

Doku etrafındaki parafin tabakasını tamamen çözmek için slaytı deparafinizasyon sıvısına batırın. Daha sonra, deparafinize edilmiş dokuyu yeniden sulandırmak için slaydı azalan etanol konsantrasyonlarına batırın. Rehidrasyonun ardından, slaytı kaynayan antijen alma çözeltisine batırın. Bu tedavi, fiksasyon işlemi sırasında değiştirilen epitopların maskesini çıkarır.

Slaytı birincil antikorlarla kaplayın ve hücre üzerinde bulunan belirli maskelenmemiş epitoplara bağlanmalarına izin verin. Ardından, birincil antikorlara bağlanan floresan etiketli ikincil antikorları ekleyin. Arka plan otofloresansını azaltmak için slaydı Sudan Black solüsyonuna batırın.

Son olarak, doku bölümünün üzerine DAPI ile takviye edilmiş bir damla montaj ortamı yerleştirin ve bir lamel ile kapatın. DAPI moleküllerinin DNA'yı lekelemesine izin vermek için inkübe edin. Hazırlanan doku kesitini bir floresan mikroskobu kullanarak görselleştirin. Hücredeki floresan etiketli epitoplar, hücre içinde bulunan nükleer DNA'yı hücre dışı DNA'dan ayırt etmeye yardımcı olur.

Hücre dışı DNA boyaması için, ilk olarak, slaytları bir çeker ocakta 40 dakikalık iki çözücü değişikliğine daldırmadan önce, ilgili numuneleri sürgülü rafta 60 santigrat derecede 60 dakika ısıtın. İkinci daldırmadan sonra, numuneleri tedavi başına 5 dakika boyunca iki kez% 100 etanol içinde ve% 70 etanol içinde bir kez rehidre edin.

Son işlemden sonra, slaytları 10 dakika boyunca yüksek bir düdüklü tencerede kaynayan antijen alma çözeltisine yerleştirmek için maşa kullanın. Antijen epitoplarını maskeledikten sonra, düdüklü tencereyi ısıdan bir lavaboya aktarın ve hemen kapağın üzerinden soğuk musluk suyu akıtın.

Numuneleri yıkama başına 5 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde 0.01 molar PBS'de iki kez yıkamadan önce slaytların antijen alma solüsyonunda 20 dakika dengelenmesine izin verin. İkinci yıkamadan sonra, böbrek dokusu örneklerinin etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini içinde 60 mikrolitre% 10% tavuk serumu ile spesifik olmayan lekelenmeleri engelleyin.

İnkübasyonun sonunda, bloke etme solüsyonunu, gece boyunca 4 santigrat derecede bir nem odasında ilgilenilen birincil antikorun 60 mikrolitresi ile dikkatlice değiştirin. Ertesi sabah, oda sıcaklığında 40 dakikalık bir inkübasyon için her slayta 60 mikrolitre uygun bir florofor konjuge ikincil antikor eklemeden önce, slaytları PBS'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama başına 2 dakika yıkayın.

İnkübasyonun sonunda, slaytları gösterildiği gibi PBS'de yıkayın, ardından herhangi bir potansiyel formalin kaynaklı otofloresanı söndürmek için% 70 etanol içinde% 0.3 Sudan Siyahı içinde muamele edin. 30 dakika sonra, herhangi bir çökeltiyi gidermek için slaytları musluk suyunda yıkayın ve daha fazla Sudan Siyahı tortusu oluşumunu önlemek için slaytları 10 dakika PBS'ye daldırın.

İnkübasyonun sonunda, slaytları DAPI ile desteklenmiş 360 mikrolitrelik damla montaj solüsyonu ile konfokal cam lamellere monte edin ve lamelleri oje ile kapatın. Slaytların oda sıcaklığında 24 saat kürlenmesine izin verin. Standart protokollere göre konfokal lazer tarama mikroskobu ile görüntülenene kadar ışıktan korunarak 4 santigrat derecede saklayın.