Sıfır hipotezi testi, podosit farklılaşmasının doğrulanması için neden önemlidir?

Podosit özelliklerinde gözlemlenen değişikliklerin farklılaşma protokolünden mi yoksa rastgele varyasyonlardan mı kaynaklandığını belirlemek için boş hipotez testi gereklidir; bu da renal araştırmalarda sağlam hedef validasyonunu destekler.

Bağımsız değişken izolasyonu, iPSC-podosit iş akışlarına nasıl entegre edilir?

Besiyeri bileşimi veya inkübasyon süresi gibi değişkenlerin izole edilmesi, ekiplerin farklılaşma sonuçlarını spesifik olarak protokol modifikasyonlarına dayandırmasına olanak tanıyarak keşif aşamasındaki optimizasyonu ve tekrarlanabilirliği artırır.

Kantitatif podosit ölçümleri nefrotoksisite deneylerinde neyi sağlar?

Podosit morfolojisinin ve canlılığının kantitatif değerlendirmesi, bileşiklerin etkilerinin objektif bir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanıyarak nefrotoksisite taraması ve assay geliştirme süreçlerinde veri odaklı kararları destekler.

Çapraz fonksiyonlu podosit çalışmaları için replikasyon gereklilikleri neden kritiktir?

Tekrarlanabilirlik, podosit farklılaşmasının ve analiz sonuçlarının ekipler ve deneyler arasında tutarlı olmasını sağlayarak, güvenilir veri paylaşımını ve iş birlikçi Ar-Ge çalışmalarını kolaylaştırır.

Podosit analizi uygulamasına geçmeden önce hangi istatistiksel analiz yeteneklerine ihtiyaç duyulur?

Diferansiyasyon verimliliğini, analiz tekrarlanabilirliğini ve işlem etkilerini analiz etmek için güçlü istatistiksel araçlar gereklidir; bu sayede podosit tabanlı verilerin, karar verme süreçleri için kurumsal Ar-Ge standartlarını karşılaması sağlanır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Böbrek Podositlerinin Türetilmesi: Olgun Böbrek Podositlerinin Kök Hücrelerden Yönlendirilmiş Farklılaşması İçin Bir Prosedür

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 4:19 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Olgun hücreler, kök hücre benzeri farklılaşmamış ve proliferatif durumlarını yeniden kazanmak için yeniden programlanabilir. Bu yeniden programlanmış hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücreler veya IPSC'ler denir. Pluripotent hücreleri, atıkların böbreklerden süzülmesinde yer alan podositlere özel hücrelere ayırmak için, bir mezoderm indüksiyon ortamında insan IPSC'lerinin bir süspansiyonunu alarak başlayın.

Bu süspansiyonu bodrum matrisi kaplı bir kültür plakasına aktarın ve inkübe edin. Bodrum matrisi, IPSC'lerin tabana yapışmasını kolaylaştırır. Daha sonra, ortamda bulunan spesifik faktörler, IPSC'lerin podositler için öncü hücreler olan mezoderm hücrelerine farklılaşmasını indükler. Harcanan medyayı aspire edin.

Plakayı istenen hacimde bir ara mezoderm indüksiyon ortamı ile destekleyin ve uzun süre inkübe edin. Bu adım, mezodermal hücrelerin olgunlaşmamış podositlere farklılaşmasına yol açar. Yapışık hücreleri plakadan ayırmak için ara mezoderm indüksiyon ortamını bir tripsin çözeltisi ile değiştirin.

Sonraki, hücreleri peletlemek için santrifüjleyin. Tripsin çözeltisi ve matris parçaları içeren süpernatanı atın. Peleti bir podosit indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu yeni kaplanmış bir kültür plakasına aktarın. Ara hücrelerden birkaç ayak benzeri çıkıntının gelişmesine izin vermek için kuluçkaya yatırın, bu da olgun podositlerin oluşumuna neden olur.

Saydıktan sonra, hücreleri mililitre mezoderm indüksiyon orta konsantrasyonu başına 1 kez 10 ila beşinci hücreye yeniden süspanse edin ve hücre dışı matris çözeltisini bazal membran matrisi 2 kaplı plakalardan aspire edin. Plakaları ılık ortamla iki kez durulayın ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre süspansiyonunu nazik pipetleme ile karıştırın.

Bazal membran matrisi 2 kaplı 12 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 1 mililitre hücre ekleyin ve hücreleri daha eşit bir şekilde dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın. Ardından, plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Farklılaşmanın 2 ila 15. günlerinde, mezoderm indüksiyon ortamını kuyucuk başına 1 mililitre ara mezoderm indüksiyon ortamı ile değiştirin.

Ortamın sararması ile belirtildiği gibi önemli hücre büyümesi ve besin maddelerinin hızlı bir şekilde tükenmesi gözlenirse, ara mezoderm farklılaşma ortamının hacmi kuyu başına 1.3 mililitreye çıkarılabilir. Kültürün 16. gününde, ara mezoderm hücrelerini ılık ortamla durulayın ve hücreleri 37 santigrat derecede 3 dakika boyunca oyuk başına 500 mikrolitre% 0.05 tripsin-EDTA ile inkübe edin.

Hücreler ayrışmaya başladığında, hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın ve hücreleri pipetleyerek nazikçe karıştırın. Oyuk başına yaklaşık 2 mililitre tripsin nötralize edici çözelti ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hacmi orta ile 50 mililitreye getirin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Pelet ve podosit indüksiyon ortamını, mililitre orta konsantrasyon başına 1 kez 10 ila beşinci hücrede yeniden süspanse edin ve hücreleri bazal membran matrisi 2 kaplı plakalara ekleyin. Ardından, hücrelerin daha eşit bir şekilde dağılmasına yardımcı olmak için plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri 5 güne kadar inkübatöre yerleştirin.