Detrusor Düz Kas Hücresi İzolasyonu: İnsan İdrar Kesesi Örneklerinden DSM Hücreleri Elde Etmek İçin Enzimatik Bir Sindirim Prosedürü

İdrar kesesi duvarında bulunan detrusor düz kas veya DSM hücreleri, mesanenin birincil fonksiyonel birimini oluşturur. Bu hücreler mesanede idrar depolanmasını kolaylaştırmak için gevşer ve idrarı serbest bırakmak için kasılır.

DSM hücrelerini izole etmek için, hasat edilmiş bir insan idrar kesesi örneği alarak başlayın. Kan ve kalıntı izlerini gidermek için numuneyi yıkayın. Daha sonra, dokuyu mukozal yüzeyi yukarı bakacak şekilde sabitleyin. Altta yatan detrusor kas tabakasını ortaya çıkarmak için yağı, kan damarlarını ve mukozal tabakayı çıkarın. Ardından, mukozasız dokuyu küçük parçalar halinde kesin.

Doku parçalarına papain içeren bir sindirim kokteyli uygulayın ve inkübe edin. Proteolitik bir enzim olan papay, hücreleri bir arada tutan hücre dışı matriksteki proteinlerin sindirimini teşvik eder ve matriksteki hücrelerin gevşemesini başlatır. Şimdi, papain içeren süpernatanı çıkarın.

Doku parçalarına kollajenaz enzim süspansiyonu ekleyin ve fizyolojik sıcaklıkta inkübe edin. Kollajenaz, hücre dışı matrisi parçalar ve DSM hücrelerinin ayrışmasını kolaylaştırır. Fizyolojik sıcaklıkta inkübasyon, DSM hücre bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur. Kollajenaz içeren süpernatanı atın.

Kalan enzimleri çıkarmak için doku parçalarını buz gibi soğuk bir tamponla yıkayın. Ardından, bunları arabellekte yeniden askıya alın. Salınmamış hücrelerin tamamen ayrışmasını sağlamak ve DSM hücrelerinin tek hücreli bir süspansiyonunu elde etmek için enzimle muamele edilen doku parçalarını nazikçe tritüre edin. DSM hücrelerini daha fazla kullanılana kadar düşük sıcaklıklarda saklayın.

Tüm kalınlıktaki idrar kesesi örneğini inceleyerek başlayın. Örneği, mukoza yukarı ve seroza aşağı bakacak şekilde, buz gibi soğuk DS ile doldurulmuş silikon enantiyomer kaplı 150 milimetrelik yuvarlak bir tabağa sabitleyin ve keskin bir diseksiyonla tüm mukozayı dikkatlice çıkarın.

Birkaç mukoza içermeyen detrusor düz kas veya DSM parçasını kesin. 3 ila 6 DSM parçasını, papain ve ditiyotreitol veya DS-P içeren 1 ila 2 mililitre önceden ısıtılmış DS içeren bir tüpe yerleştirin. Onları 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika inkübe edin ve tüpü her 10 ila 15 dakikada bir salladığınızdan emin olun.

İnkübasyondan sonra, DS-P'yi tüpten çıkarın ve DSM parçalarını buz gibi soğuk DS ile kısa bir süre yıkayın. DSM parçalarına sahip DS'yi yeni bir tüpe aktarın ve DSM parçalarını tüpün altında bırakarak DS'yi çıkarın. Tüpe kollajenaz tip II veya DS-C içeren 1 ila 2 mililitre DS ekleyin ve ara sıra çalkalayarak 37 santigrat derecede inkübe edin.

DS-C'yi atın ve enzimle muamele edilmiş DSM parçalarını buz gibi soğuk DS ile 5 ila 10 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, DS'yi tüpün içinde bırakın ve tek DSM hücrelerini serbest bırakmak için parçaları ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile nazikçe ezin.