JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:35 dk. • April 30th, 2023
Omurgalı böbreklerinde, nefronlar, atıkların vücuttan filtrelenmesinde birincil rol oynayan yoğun bir kan damarı ağı olan çoklu glomerüllerden oluşur.
Glomerülleri izole etmek için, yeni kesilmiş bir fare böbreği alarak başlayın. Böbrek kapsülünü böbrekten ayırmak için forseps kullanın ve temiz böbreği yeni bir kültür kabına koyun. Şimdi, böbrek bozulmasını önlemek için tabağı buzun üzerine yerleştirin. Böbreği küçük parçalar halinde kıyın.
Daha sonra, kıyılmış böbrek parçalarını uygun bir tampon çözeltisinde tekrar süspanse edin. Doku süspansiyonunu büyük boyutlu bir ağ filtreden süzün ve akışı taze bir tabakta toplayın. Glomerüller böbrek parçalarından ayrılana kadar her seferinde ağ boyutunu kademeli olarak azaltırken bu adımı birkaç kez daha tekrarlayın.
Son olarak, böbrek parçaları süzüntüde kalırken daha küçük sıkışmış glomerülleri toplamak için filtreyi istenen kültür ortamıyla yıkayın. Glomerülleri ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın. Ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak plakayı görselleştirin.
Bir mikropipet yardımıyla, tek bir glomerulus yakalayın ve taze bir kuyuya aktarın. Kuyuyu kültür ortamı ile destekleyin ve daha fazla analiz için izole edilmiş glomerulusu kullanın.
Metin el yazmasında belirtildiği gibi böbrekleri serbest bıraktıktan sonra, böbreği cerrahi forseps ile tutun ve böbrek kapsüllerini çıkarmak için başka bir forseps kullanın. Bundan sonra, böbrekleri her biri 2 mililitre HBSS içeren 6 oyuklu bir kültür plakasının kuyularına yerleştirin ve kültür plakasını buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra, böbrekleri 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve yaklaşık 1 ila 2 milimetrelik küçük parçalar halinde doğramak için iki neşter kullanın. Kıyılmış böbrek parçalarını HBSS ile ıslak tutun.
Daha sonra, böbrek parçalarını 300 mikrometrelik bir metal eleğin üzerine yerleştirin ve 20 mililitrelik bir şırınganın pistonunu kullanarak böbreği elekten geçirin. Süzgeci arada HBSS ile tekrar tekrar durulayın ve akışı toplamak ve temiz bir Petri kabına aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
Eleğin dibinde kalan her şeyi sıyırmak için bir neşter kullanın ve toplanan böbrek homojenatına aktarın. Böbrek homojenatını HBSS ile 75 ve 53 mikrometrelik bir elek ile durulayın. Ardından, tüm küçük yapıları çıkarmak için her iki eleği de HBSS ile yıkayın.
Her birinin üst yüzeyini %20 fetal buzağı serumu ile takviye edilmiş DMEM ile yıkayarak eleklerde kalan böbrek yapılarını ve materyali toplayın ve materyali 6 oyuklu ultra düşük bağlantılı bir mikroplakanın kuyucuklarına aktarın.
Ultra düşük bağlantılı mikroplakayı ters çevrilmiş bir ışık mikroskobuna getirin ve tek kapsüllenmiş ve/veya dekapsüle edilmiş glomerülleri toplamak için 20 mikrolitrelik bir pipet kullanın.