Eksozom İzolasyonu: Kültürlenmiş Hücrelerin Şartlandırılmış Ortamlarından Eksozomları Ayırmak için Sükroz Yastığı Kullanan Yoğunluğa Dayalı Bir Ultrasantrifüjleme Tekniği

Eksozomlar - fonksiyonel biyomoleküller taşıyan nano boyutlu, zara bağlı veziküller - çoğu hücre tipi tarafından aktif olarak salgılanır ve in vitro hücre kültürü süpernatanlarından izole edilebilir. Eksozomları izole etmek için, önce süpernatan veya şartlandırılmış ortamı ilgilenilen bir hücre kültüründen hasat edin. Şartlandırılmış ortam, eksozomlar, proteinler, hücresel kalıntılar ve veziküller içerecektir.

Hücresel kalıntıları peletlemek için ortamı santrifüjleyin. Eksozom içeren süpernatanı toplayın ve daha büyük vezikülleri çıkarmak için hücre süzgeçlerinden süzün. Filtrelenmiş ortamın belirli bir hacmini yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, süreksiz bir sakaroz gradyanı olan bir sakaroz yastığı hazırlamak için uygun konsantrasyonlarda sükroz ve döteryum oksit karıştırın.

Ortam içeren tüpe belirli bir hacimde sükroz yastık çözeltisi ekleyin; çözelti altta ayrı bir tabaka oluşturur. Şimdi, tüpü yüksek hızda santrifüjleyin. Sükroz yastığı, eksozom bütünlüğünü korurken eksozomların ortamdan sükroz çözeltisine göçünü kolaylaştırır. Yüksek yoğunluklu protein kirleticileri, sükroz çözeltisi ile ortam arasındaki arayüzü işgal eder.

Eksozom içeren sükroz tabakasının ana fraksiyonunu uygun bir tampon ile yeni bir tüpe dikkatlice aktarın. Saflaştırılmış eksozomlardan oluşan bir pelet elde etmek için yüksek hızda santrifüjleyin. Sükroz içeren süpernatanı herhangi bir protein kontaminantıyla birlikte atın. Eksozom peletini tamponda yeniden süspanse edin ve daha fazla kullanılana kadar düşük sıcaklıklarda saklayın.

Toplanan şartlandırılmış ortamı önceden temizlemek için, 500 santigrat derecede 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Bu santrifüjleme adımını geri kazanılan süpernatan ile tekrarladıktan sonra, süpernatanı tekrar geri kazanın ve peleti atın.

Ardından, geri kazanılan süpernatanı 2.000 x g'da 15 dakika ve 4 santigrat derece santrifüjleyin. Süpernatanı saklayın ve peleti atın. Süpernatanı, 20 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 0.22 mikrometre filtreden bir kez taze bir santrifüj tüpüne süzün.

Bu arada, döteryum oksit içinde% 25 sükroz çözeltisi hazırlamak için, evrensel bir tüpte 1.9 gram sükrozu doğru bir şekilde tartın. Ardından, ağırlık 7.6 grama ulaşana kadar döteryum oksit ekleyin. Ardından, bir ultrasantrifüj tüpünü 22,5 mililitre önceden temizlenmiş şartlandırılmış ortamla doldurun.

Tüpe bir cam pipet yerleştirin. Pipetten 3 mililitre sükroz çözeltisi ekleyin, böylece çözelti şartlandırılmış ortamın altında ayrı bir tabaka oluşturur. Katmanlı şartlandırılmış orta sükroz çözeltisi içeren tüpü, açılır bir rotorun kovasına dikkatlice yerleştirin.

Kovayı rotora sabitleyin. Rotoru ultrasantrifüje yerleştirin ve 1,5 saat boyunca 4 santigrat derecede 100.000 x g döndürün. Ucu 10 mikrolitrelik bir uca bağlı bir P1000 pipeti kullanarak tüpten 2 mililitre sükroz tabakası toplayın ve yıkama için 20 mililitre filtrelenmiş PBS içeren bir ultrasantrifüj şişesine ekleyin.

Tüpü sabit açılı bir rotora yerleştirin ve 1,5 saat boyunca 4 santigrat derecede 100.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Peletleri 400 mikrolitre filtrelenmiş PBS ile yeniden süspanse edin.