JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:04 dk. • April 30th, 2023
Eksozomlar - nano boyutlu, hücre kaynaklı zar vezikülleri - çift sarmallı küçük enterferans yapan RNA veya siRNA için terapötik dağıtım araçları olarak potansiyel sergiler.
Hedef hücrenin sitoplazmasına salındıktan sonra siRNA, RNA'nın neden olduğu susturma kompleksine bağlanır. Aktive edilmiş kompleks daha sonra spesifik mRNA'yı tanır ve ona bağlanır, ekspresyonunu negatif olarak düzenler ve gen susturulmasına aracılık eder.
siRNA'yı eksozomlara kapsüllemek için önce bir elektroporasyon küvetini buz üzerinde soğutun. Daha sonra, eksozomları ve spesifik siRNA'yı uygun bir elektroporasyon tamponu kullanarak istenen oranda bir tüpte karıştırın. Şimdi bu karışımı önceden soğutulmuş küvete aktarın.
Küveti kapatın ve elektroporatörün küvet tutucusuna yerleştirin. Küvetin elektroporasyon elektrotlarıyla temas ettiğinden emin olmak için dönen tekerleği döndürün. Şimdi, seçilen elektroporasyon programını çalıştırın.
Elektroporasyon sırasında, elektrik darbeleri, iletken tamponda asılı kalan eksozomların fosfolipid çift tabakasını bozar. Bu, eksozom zarında geçici gözeneklerin oluşumuyla sonuçlanır ve siRNA'nın veziküle difüzyonunu teşvik eder. Tampon, siRNA agregasyonunu önlemeye yardımcı olur.
Elektroporasyon tamamlandığında, gözenekler yeniden kapanır ve siRNA'yı içinde hapseder. Son olarak, küveti elektroporatörden çıkarın ve karışımı yeni bir tüpe aktarın. siRNA kapsüllü eksozomları daha fazla kullanıma kadar düşük sıcaklıklarda saklayın.
Elektroporasyona başlamadan önce, elektroporasyon küvetini 30 dakika boyunca buz üzerinde önceden soğutun. Mikrosantrifüj tüpünde 7 mikrogram eksozomu 0.33 mikrogram siRNA ile karıştırın. 150 mikrolitre hacim elde etmek için bir sitrik asit tamponu ekleyin. Eksozom-siRNA karışımını plastik bir pipet kullanarak elektroporasyon küvetine ekleyin ve küveti kapatın.
Küveti elektroporatörün küvet tutucusuna doğru yönde yerleştirin ve elektroporatörün dönen tekerleğini saat yönünde 180 derece çevirin. İstediğiniz programı seçin ve elektroporasyonu başlatmak için Başlat düğmesine basın. Ekran başarılı bir nabız gösterecektir.
Ardından tekerleği saat yönünün tersine 180 derece geri çevirin ve küveti çıkarın. Numuneyi küvetten yeni bir mikrosantrifüj tüpüne çıkarmak için plastik bir pipet kullanın. Hemen kullanılmayacaksa, daha fazla işlem yapmadan önce tüpü buz üzerinde veya buzdolabında saklayın.