JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:21 dk. • April 30th, 2023
Renal tübüler epitel hücrelerini veya TEC'leri izole etmek için, bir Petri kabında yeni izole edilmiş bir fare böbreği alarak başlayın. Böbreği çevreleyen ince dış tabaka olan böbrek kapsülünü soyun ve medullayı veya böbreğin en iç kısmını çıkarın, tübül ve tübüler epitel hücrelerini içeren korteksi bırakın.
Kalan böbrek parçalarını küçük parçalar halinde doğrayın ve kollajenaz enzimi içeren ılık bir sindirim tamponunda inkübe edin. Kollajenaz, böbrek dokularını bir arada tutan kollajen proteinini parçalayarak renal tübülleri ve böbrek hücrelerini süspansiyona bırakır.
Sindirilmemiş böbrek dokularını çıkarmak için süspansiyonu süzün. Ardından, süzüntüye önceden soğutulmuş kültür ortamı ekleyin. Düşük sıcaklık kollajenazı nötralize eder ve daha fazla doku sindirimini durdurur. Diğer hücre tipleri ve safsızlıklar askıda kalırken daha yoğun tübüllerin ve tübüler hücrelerin çökmesine izin vermek için süzüntüyü düşük hızda santrifüjleyin.
Bu istenmeyen süpernatan fraksiyonu çıkarın ve peleti yeniden süspanse etmek için kültür ortamı ekleyin. Süspansiyonu kollajen kaplı bir kültür kabına tohumlayın ve inkübe edin. Serbest tübüler hücreler kollajene sıkıca bağlanırken, tübüller askıda kalır. Bağlanmamış tübülleri çıkarmak ve tübüler epitel hücrelerinin birincil kültürünü elde etmek için alt kültür.
Hasat edilen böbrekleri işlemek için önce böbrek kapsüllerini ve medullayı çıkarın. Daha sonra, her iki böbreği de küçük parçalar halinde kıyın ve 10 mililitrelik bir sindirim tamponunda 37 derecelik bir fırında 5 dakika boyunca hafifçe döndürerek inkübe edin.
Sindirimden sonra, tamponu 70 mikronluk bir filtreden geçirerek sindirilmemiş dokuları çıkarın. Sindirilmiş dokuyu topladıktan sonra, sindirimi durdurmak için 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Daha sonra, tübüler hücreleri peletlemek için filtrelenmiş doku süspansiyonunu 50 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın, 5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve kalan tübüler hücreleri toplamak için santrifüjlemeyi tekrarlayın.
Şimdi, ilk peleti 20 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve toplanan hücreleri daha da saflaştırmak için 5 dakika boyunca 50 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Ardından, her iki peleti de 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, Tripan Mavisi boyamayı kullanarak canlı hücreleri sayın. Ardından, 60 milimetrelik kollajen kaplı bir tabağa 10 milyona kadar hücre ekin ve boru şeklindeki hücrelerin gece boyunca bağlanmasına izin verin.