JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:18 dk. • April 30th, 2023
Glomerulus, böbrek içindeki atıkları filtreleyen ve kandaki fazla sıvıyı uzaklaştıran karmaşık bir kılcal damar ağıdır. Böbrek filtrasyon hızı, Periyodik Asit Schiff veya PAS boyası kullanılarak incelenebilen bu özel yapıya bağlıdır.
Başlamak için, bir cam slayt üzerinde parafinli bir böbrek korteksi bölümü alın. Slayta ksilen ile muamele edin. Ksilen molekülleri, parafin mumunu doku bölümünden çözer. Daha sonra, numuneyi azalan alkol konsantrasyonlarına maruz bırakın. Alkol, lekenin daha sonra bağlanması için doku bölümünü yeniden sulandırırken ksilen izlerini giderir.
Şimdi, numuneye periyodik asit ekleyin. Periyodik asit, glikojen veya müsin gibi doku polisakkaritlerinde bulunan diolleri aldehitlere dönüştürür. Bu aldehitler, bir fuksin-sülfürik asit kombinasyonu olan Schiff reaktifi ile reaksiyona girerek doku bölümünü lekeleyen macenta renkli bir boya oluşturur. Fazla lekeyi çıkarmak için slaytı durulayın.
Durulamadan sonra, DNA'ya bağlanan ve onu mora boyayan nükleer bir karşı leke olan demir-hematoksilen ekleyin. Fazla lekeyi çıkarmak için yıkayın. Son olarak, numuneyi artan alkol güçleri ve ardından bir temizleme maddesi olarak işlev gören ksilen ile kurutun. Bu adım, mikroskobik inceleme için doku bölümünün kontrastını iyileştirmeye yardımcı olur.
Glomerüler hastalık, bazal zarın kalınlaşması, değişmiş kılcal damarlar ve bozulmuş böbrek fonksiyonu ile ilgili anormal hücreler olarak görselleştirilebilir.
Glomerüler hücrelerin ve mezanjiyal matrisin ayrıntılı görselleştirilmesi için, sabit parafine gömülü böbrek korteks örneklerini 1 saat boyunca 37 santigrat derecede kurutun, ardından ardışık ksilen ve azalan etanol daldırmaları ile deparafinizasyon yapın. Numuneleri damıtılmış suda 5 dakika rehidre edin ve slaytları bir duman kabininde Periyodik Asit çözeltisi içinde inkübe edin.
5 dakika sonra, slaytları 100 mililitre damıtılmış suda 5 dakikalık üç yıkama ile durulayın, ardından Schiff reaktifinde 15 dakikalık bir inkübasyon yapın. İnkübasyonun sonunda, slaytları 5 dakika boyunca akan musluk suyunda yıkayın ve akan musluk suyunda 15 dakika daha iyice durulamadan önce 3 saniye boyunca hematoksilen ile lekeleyin.
Ardından, slaytları artan etanol daldırmaları ve iki ardışık 3 dakikalık ksilen daldırması ile kurutun. Havayla kurutulduktan sonra, slaytlar, glomerüler yapılarının 400X büyütmede bir ışık mikroskobu üzerinde değerlendirilmesi için ksilen bazlı montaj ortamı ile monte edilebilir.