Ters Fazlı Protein Dizileri Tabanlı Protein Ekspresyon Analizi: Hücre Lizatından Çoklu Proteinlerin Ekspresyonunun Eş Zamanlı Miktar Tayini İçin Bir Prosedür

Bir tümör örneği, heterojen bir protein popülasyonu içerir. Tümör lizatı kullanılarak, ilgilenilen proteini tanımlamak için bu tür çoklu proteinler paralel olarak analiz edilebilir. Bu yüksek verimli tekniğe Ters Faz Protein Dizileri veya RPPA denir.

RPPA'yı gerçekleştirmek için, nitroselüloz ile kaplanmış bir immünoassay cam lam alarak başlayın. Slaytta bir dizi tümör lizat proteini bulun. Nitroselüloz üzerinde protein yakalanmasına izin vermek için inkübe edin. Daha sonra, slaytı, proteinler üzerindeki spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke eden bir bloke edici tampon ile tedavi edin.

Fazla engelleme solüsyonunu çıkarın. Şimdi, protein kaplı slaytı bir tutucuya monte edin ve sıkıca kapatın. Bu, kayma yüzeyi üzerinde geçici kuyular oluşturur. Daha sonra, kuyucukları bir birincil antikor çözeltisi ile yükleyin. Bu antikorlar, dizi üzerindeki bir protein karışımından karşılık gelen hedefte bulunan epitopları tanır.

Son olarak, floresan etiketli ikincil antikorlar ekleyin. Bu antikorlar, bir kompleks oluşturan önceden bağlanmış birincil antikorlara bağlanır. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için slaytı yıkayın. Sürgüyü tutucudan açın ve kurumaya bırakın.

Floresan tarayıcı kullanarak slaydı tarayın. Antikor etiketli hedef proteinler belirli bir dalga boyunda floresan olur ve slayt yüzeyinde renkli noktalar olarak görünür.

RPPA baskısından önce, her numuneden beş adet iki katlı seyreltme serisi yapılır. Bu prosedürün en çok zaman alan yönlerinden biri yüzlerce seyreltme yapmaktır. Slaytları yazdırmadan önce iki kez kontrol edilerek başarılı bir sonuç elde edilebilir.

Daha sonra nitroselüloz kaplı cam slaytlar üzerindeki protein lizatlarını tespit etmek için bir MicroGrid II robotik gözcü kullanılır. Her numune üç nüsha halinde lekelenir ve numune başına toplam 15 nokta elde edilir. Bu deneyde kullanılan slaytlar, numunelerin lekelendiği iki ped içerir. Her ped aynı numunelerle, bu durumda 100 numunelerle tespit edildi. Diğer kullanılabilir biçimler arasında 1, 8 ve 16 ped slaytları bulunur. Ped sayısı ne kadar yüksek olursa, her birinde tespit edilebilecek numune sayısı o kadar az olur.

Protein tespiti prosedürüne başlamak için, slaytları fazla bloke edici tamponda ıslatın ve sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İstenilen konsantrasyonlarda bloke edici tamponda 800 mikrolitre primer antikor hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Blokaj tamponunda bir saatlik inkübasyondan sonra, slaytları tek çerçeveli Chip Clip'e veya FastFrame dört yuvalı kayar tutucuya monte edin, böylece lam ile inkübasyon odası arasında sıkı bir sızdırmazlık oluşur.

Artık tamponu kuyulardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara 600 mikrolitre primer antikor ekleyin. Slaytları ve hazneyi kapalı bir ıslak kutuya yerleştirin ve gece boyunca 4 santigrat derecede sallanan bir platformda inkübe edin. Ertesi sabah, slaytları soğuk odadan çıkarın. Birincil antikorları her bir kuyucuktan dikkatlice çıkarın. 600 mikrolitre% 0.1 PBS-Tween20 veya PBS-T ekleyin ve slaytları oda sıcaklığında sallanan bir platformda 5 dakika yıkayın.

PBS-T'yi yeni PBS-T ile değiştirin. Bu şekilde kızakları toplam üç kez yıkayın. Tamponu kuyucuklardan çıkarın ve ilgili kuyucuklara uygun seyreltmede 600 mikrolitre floresan etiketli ikincil antikor ekleyin. İkincil antikorlarla oda sıcaklığında 45 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Membranın taranacağı zamana kadar ışıktan korunması önemlidir. 45 dakika sonra, ikincil antikorları kuyucuklardan çıkarın ve oda sıcaklığında 600 mikrolitre PBS-T'de üç kez kısa bir süre yıkayın.

Slaytları taşıyıcıdan çıkarın, uygun bir kaba aktarın ve fazla PBS-T'yi 15 dakika boyunca yıkayın, zarı karanlıkta tutun. PBS-T'yi çıkarın ve kalan Tween20'yi çıkarmak için membranı oda sıcaklığında 15 dakika PBS ile yıkayın ve membranı tekrar karanlıkta tutun. Fastslides'ı 50 derecelik fırında 10 dakika kurutun. Son olarak, kullanılan ikincil antikorlara bağlı olarak slaytları 680 nanometre ve / veya 800 nanometrede tarayın.