Ters Fazlı Protein Dizileri Tabanlı Protein Ekspresyon Analizi: Hücre Lizatından Çoklu Proteinlerin Ekspresyonunun Eş Zamanlı Miktar Tayini İçin Bir Prosedür

Bir tümör örneği, heterojen bir protein popülasyonu içerir. Tümör lizatı kullanılarak, ilgilenilen proteini tanımlamak için bu tür çoklu proteinler paralel olarak analiz edilebilir. Bu yüksek verimli tekniğe Ters Faz Protein Dizileri veya RPPA denir.

RPPA'yı gerçekleştirmek için, nitroselüloz ile kaplanmış bir immünoassay cam lam alarak başlayın. Slaytta bir dizi tümör lizat proteini bulun. Nitroselüloz üzerinde protein yakalanmasına izin vermek için inkübe edin. Daha sonra, slaytı, proteinler üzerindeki spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke eden bir bloke edici tampon ile tedavi edin.

Fazla engelleme solüsyonunu çıkarın. Şimdi, protein kaplı slaytı bir tutucuya monte edin ve sıkıca kapatın. Bu, kayma yüzeyi üzerinde geçici kuyular oluşturur. Daha sonra, kuyucukları bir birincil antikor çözeltisi ile yükleyin. Bu antikorlar, dizi üzerindeki bir protein karışımından karşılık gelen hedefte bulunan epitopları tanır.

Son olarak, floresan etiketli ikincil antikorlar ekleyin. Bu antikorlar, bir kompleks oluşturan önceden bağlanmış birincil antikorlara bağlanır. Bağlanmamış ikincil antikorları çıkarmak için slaytı yıkayın. Sürgüyü tutucudan açın ve kurumaya bırakın.

Floresan