Nefrotoksinlerin Zebra Balığı Embriyosuna İntravenöz Mikroenjeksiyonu: Nefrotoksik Ajanları Zebra Balığı Embriyosunun Kan Dolaşımına Verme Tekniği

İntravenöz mikroenjeksiyon, ilgilenilen moleküllerin bir alıcı hayvanın kan dolaşımına verilmesini kolaylaştırır. Nefrotoksinleri bir zebra balığı embriyosuna vermek için, önce istenen nefrotoksin çözeltisinin uygun bir konsantrasyonunu hazırlayın.

İnce bir jel yükleme ucu kullanarak, bu nefrotoksin solüsyonunu keskin köşeli uçlu bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin. Nefrotoksin çözeltisinin iğne ucunu yerçekimi ile doldurmasına izin vermek için iğneyi dikey olarak askıya alın. Şimdi, yüklenen mikroenjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatörün tutucusuna sabitleyin.

Daha sonra, uyuşturulmuş bir zebra balığı embriyosunu prefabrike mikroenjeksiyon kalıbına aktarın. Kalıptaki embriyoyu, başı kuyu içinde ve kuyruğu kuyudan dışarı bakacak şekilde hizalayın, böylece mikroenjeksiyon için kuyruğa erişilebilirliği artırın. Ardından, iğne ucunu tam olarak embriyonun yanına yerleştirin.

Nefrotoksin çözeltisini embriyonun kuyruk damarına enjekte edin. Enjekte edilen nefrotoksik ajanlar dolaşım yoluyla yayılır ve böbrek gibi uzak organlara ulaşır. İğneyi yavaşça geri çekin. Embriyoyu, embriyo ortamı içeren taze bir tabağa aktarın ve iyileşmesine izin verin. Embriyoyu belirli bir süre inkübe edin.

Enjeksiyondan sonraki saatler içinde, nefrotoksinler böbrekte birikir ve hasara neden olarak böbrek fonksiyonlarında bir azalmaya yol açar.

Enjeksiyon gününde, uygun araç kontrolü ile istenen nefrotoksin solüsyonunu hazırlayın. Vorteks yapın veya hafifçe karıştırın. Daha sonra, ilaçların çözelti içinde çözüldüğünden emin olmak için tüpün kenarlarını ve su sütununun üstünü kontrol edin.

İğnenin arkasına ince bir jel yükleme ucu geçirerek 2 ila 3 mikrolitre nefrotoksin içeren kesilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin ve çözeltinin kesilmiş iğne ucunu yerçekimi ile doldurmasına izin vermek için iğneyi bir parça bantla dikey olarak askıya alın.

İğne ucu dolduğunda, yüklenen iğneyi mikromanipülatöre sabitleyin. Bir mikrometre lamına bir damla mineral yağ koyarak mikroenjeksiyon hacmini test edin ve damlacık boyutunu değerlendirmek için yağa enjekte edin.

Daha sonra, embriyo kabını inkübatörden çıkarın ve embriyo kabına 5 mililitre% 0.2 Trikain ekleyerek uyuşturun. Daha sonra, embriyoları bir transfer pipeti ile enjeksiyon kalıbına aktarın. Her bir embriyoyu kalıbın farklı bir kuyucuğuna doğru manevra yapın, kafayı kuyunun en derin bölgesine, gövde çöküntü boyunca dayanacak ve kuyruk dışarı çıkacak şekilde yerleştirin.

Şimdi, doldurulmuş iğneyi mikromanipülatöre yerleştirin ve iğne ucunu bir embriyonun yanına yerleştirin. Mikroenjeksiyon için iğneyi yavaşça kuyruk damarına sokun.

İşlemin en kritik basamağı mikroenjeksiyondur. Başarıyı sağlamak için, iğne keskin bir açıyla kesilmeli ve embriyonun yanındaki konuma dikkatlice hareket ettirilmelidir.

Enjeksiyon başarılı olursa, sıvının dolaşıma girdiğini görmelisiniz. Nefrotoksiktanın floresan konjuge dekstran ile birlikte enjeksiyonu, araştırmacının prosedürden sonra başarılı enjeksiyonu doğrulamasını sağlayacaktır. Daha sonra, iğneyi embriyodan nazikçe çıkarın.

Embriyoyu temiz bir tabağa aktarın ve Trikaini taze E3 / PTU ile çıkarmak için durulayın. Daha sonra, metilselüloz montaj ortamında fotoğrafla belgelenebilen morfolojiyi değerlendirmek için embriyoyu istenen zaman noktasına kadar inkübe edin veya istenildiği gibi deneysel analiz için işlem yapın.

Embriyoların geri kazanımının, genellikle böbrek hasarını gösteren ödemli bireylerin yüzdesini belirlemek için enjeksiyondan sonra her 12 ila 24 saatte bir değerlendirilmesi gerektiğini unutmayın.