Fare Glomerüllerinden Sıvı Aspirasyonu: İki Foton Aracılı Mikropunktur Kullanarak Fareden Glomerüler Sıvıyı Aspire Etme Yöntemi

Böbrekte, glomerulus - Bowman'ın kapsülünün içine yerleştirilmiş küçük kan damarlarından oluşan bir demet - kan filtrasyonunu başlatır ve atık sıvıyı çevredeki Bowman'ın alanına atar. Glomerüler sıvı içeriğinin araştırılması böbrek fizyolojisinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Glomerüler sıvıyı aspire etmek için, böbreği cerrahi olarak dışlanmış anestezi uygulanmış bir fare hazırlayın. Şimdi, farenin göz yörüngesinin arkasındaki kan damarlarına floresan-dekstran boya enjekte edin. Floresan-dekstran molekülleri kan dolaşımında hareket eder ve böbreğe ulaşır.

Dekstranın yüksek moleküler ağırlığı nedeniyle, floresan boya glomerulus içinde tutulur ve ona yeşil bir renk verir. Derin oturmuş yapıların görüntülenmesine izin veren iki fotonlu bir mikroskop altında, glomerüler sıvıya yeterli erişim sağlamak için uygun bir glomerulus bulun.

Ardından, kırmızı floresan nanopartikül kaplı bir mikropipet ucunu böbreğin yanal ekseni ile hizalayın. Bir mikromanipülatör kullanarak, pipet ucunu böbreğe nüfuz edecek şekilde ilerletin. Uç hedef glomerulusa ulaştığında, glomerüler sıvıyı Bowman'ın boşluğundan aspire etmek için istenen aspirasyon hızını ayarlayın.

Kırmızı pipet ucunun içinde yeşil floresan olmaması, kanama olmadığını gösterir ve başarılı glomerüler sıvı aspirasyonunu doğrular. Ardından, pipeti geri çekin ve daha fazla analiz için sıvıyı uygun bir tamponda saklayın.

Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt verilmediğini doğruladıktan sonra, gözlere merhem sürün ve 20 ila 25 gramlık yetişkin bir farenin ekstremitelerini hareketsiz hale getirmek için bant kullanın. Hayvanın sol tarafındaki tüm tüyleri almak için tüy dökücü bir krem kullanın ve dalağın dorsal ve kaudal tarafındaki deriden sol böbreği bulmak için dalağı kullanın.

Deride 0,5 santimetrelik bir kesi yapın, ardından peritonda daha küçük bir kesi yapın, böbreğin itilmesi için yeterince büyük. Böbreği hafif bir basınçla ekstrüde edin ve dokunun etrafına bir polisiloksan böbrek stabilizatörü formu yerleştirin. Böbreğin en yan yüzeyi stabilizatörün ötesine yaklaşık 1 milimetre uzanacak şekilde böbreği ara parça ile hizalayın ve böbreği siyanoakrilat yapıştırıcı ile forma sabitleyin. Stabilizatör formuna bir kafa plakası yapıştırın ve kafa plakasını taban plakasındaki montaj çubuklarına monte edin.

Daha sonra, polisiloksan desteğindeki kuyucuğu% 1 agaroz çözeltisi ile doldurun ve agaroz sertleşene kadar formun üzerine 10 milimetrelik bir lamel tutun. Lameli baş plakasına yapıştırıcı ile kapatın ve lamel etrafında diş çimentosu ile bir halka oluşturun. Daha sonra, retro-orbital olarak 100 ila 150 mikrolitre FITC-dekstran enjekte edin ve fareyi ve sabitleme plakasını hızlı bir şekilde iki fotonlu mikroskop aşamasına getirin.

Böbrek yüzeyine manuel olarak odaklandıktan sonra, taramasız iki foton moduna geçin ve lamel altında 30 mikrometreden daha büyük ve lateral böbrek kapsülünden 400 mikrometreden daha az olan bir hedef glomerulusu bulmak için görüntüleme penceresini keşfedin. Hedef glomerulusa olan yanal ve dikey mesafeyi kaydedin. Ardından, glomerulus için x, y ve z aşama koordinatlarını kaydedin ve son olarak, x ve y aşama koordinatlarını değiştirmeden objektif odak noktasını su sütununa yaklaşık 1 milimetre yükseltin.

Pipet ucunu su sütununa sürün ve DAPI uyarımını açın. Pipeti X ve Y boyutlarında, ucun maksimum floresan noktasına getirin. Burası hedefin merkezi olacak. Uyarma ayarını kırmızı floresan proteini olarak değiştirin ve oküler görünümde hassas merkezlemeye izin vermek için pipeti oküler ile görselleştirin.

Canlı iki foton görünümünün altındaki pipeti bulmak için iki fotona geri dönün ve ucu tam olarak görüntünün ortasına yerleştirin. Bu kayıt pozisyonudur. Ardından, pipetin bir görüntüsünü kaydedin ve aşamayı ve mikropipet denetleyici koordinatlarını kaydedin. Y ve Z eksenlerini hareket ettirmeden pipeti x eksenindeki su sütunundan çıkarın ve pipet Z'yi hedef glomerulus Z koordinatına ve böbreğin kenarına hareket ettirin.

Aşama X'e dikkat edin ve kayıt aşamasından uzaklık olan X'i kullanarak böbrek kenarı pipeti X'i hesaplayın. Böbreğin kenarı ekranın en soluna kadar görünür kalana kadar aşamayı pipete doğru hareket ettirmek için X aşamasını artırın. Pipeti, az önce hesaplandığı gibi böbrek kenarı pipeti X'ten yaklaşık 100 mikrometre uzağa hızla ilerletin. Kırmızı piksel histogramını izlerken kırmızı kazancı artırın ve canlı iki fotonlu görüntüleme altında pipet ucunu yavaşça böbrek kenarına doğru ilerletmeye başlayın.

Pipeti x ekseninde yavaşça glomerulus hedef pipeti X'e doğru sürün ve gözünüz X aşamasında olsun. Glomerulusa ulaştığınızda, konumu bir Z yığını ile belgeleyin. Pipet yerindeyken, pipetin açıklığını sağlamak ve giriş sırasında pipetin tıkanmasından kaynaklanan karışıklığı azaltmak için mikro pompayı 2 dakika boyunca 100 nanolitre perflorodekalin enjekte edecek şekilde ayarlayın. 4 ila 6 dakikalık filtrelemeden sonra, mikro pompayı dakikada 50 nanolitreye kadar bir hızda 300 nanolitreye kadar aspire edecek şekilde ayarlayın.