JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:17 dk. • April 30th, 2023
Glioma kök hücreleri veya GSC'ler, beyindeki glial hücrelerin kanseri olan gliomun bir alt popülasyonudur.
Bu GSC'leri lusiferaz gibi biyolüminesan enzimlerle etiketlemek, ilaç taraması için yüksek verimli görüntüleme tahlillerinin oluşturulmasına yardımcı olur.
Lusiferaz etiketli GSC'leri hazırlamak için, uygun bir büyüme ortamında bir GSC kültürü ile başlayın.
Bir hücre peleti elde etmek için kültürü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Pelete uygun sindirim enzimleri ekleyin. Bu enzimler, hücre kümelerini ayırır ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için herhangi bir bağ dokusu izini bozar.
Şimdi, tek hücreli süspansiyonu santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti taze bir ortamda yeniden süspanse edin.
Daha sonra, istenen hücre konsantrasyonunu bir kültür plakasına tohumlayın.
Kültürü inkübe edin ve hücrelerin kültür plakasına yapışmasına izin verin.
Daha sonra, lusiferaz ile zenginleştirilmiş yeşil floresan proteini veya EGFP için virüs içeren bir gen yapısının istenen titresini ekleyin ve inkübe edin.
Virüs, GSC'lerin yüzey reseptörleri ile etkileşime girerek lusiferaz-EGFP içeren viral RNA'nın salınımını tetikler. Hücresel enzimler, RNA'nın çift sarmallı DNA'ya ters transkripsiyonunu katalize eder ve onu GSC'lerin genomuna entegre eder.
Bir floresan mikroskobu altında görüntülendiğinde, lusiferaz eksprese eden hücreler, EGFP tarafından yayılan floresan nedeniyle yeşil görünür.
Glioma kök hücrelerini veya GSC'leri kültür ortamından toplayarak ve bunları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 70 x g'da santrifüjleyerek başlayın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede 4 dakika boyunca akutaz ile sindirin.
200 mikrolitrelik bir uç kullanarak, hücre peletini ayırmak ve yeniden süspanse etmek için hücreleri tekrar tekrar pipetleyin. GSC'leri 1 mililitre kültür ortamında 200.000 hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir kültür plakasının her bir oyuğuna ekleyin ve gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, plakanın her bir oyuğuna 30 mikrolitre lusiferaz-EGFP virüsü süpernatanı ekleyin. Hücreleri 1.000 x g'da 25 santigrat derecede 2 saat santrifüjleyin ve gece boyunca inkübe edin.
Ertesi gün, GSC'leri toplayarak, santrifüj ederek, süpernatanı çıkararak, taze ortamda yeniden süspanse ederek ve yeniden kaplayarak kuyulardaki ortamı değiştirin. Hücreleri 48 saat daha kültürleyin.
Plakayı floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve GFP pozitif hücrelerin görünümünü onaylayın.