Çekirdeklerin Gradyan Santrifüj Tabanlı Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme Kullanılarak Bozulmamış Çekirdeklerin Ultra Saf Fraksiyonunu Elde Etme Tekniği

Sağlam çekirdekleri izole etmek ve saflaştırmak için, bir tüpte ham bir çekirdek fraksiyonu alarak başlayın. Fraksiyon, kırık çekirdek parçaları ve döküntülerle birlikte sağlam çekirdekler içerir.

Bu fraksiyonu, en düşük konsantrasyonda bir süspansiyon oluşturacak şekilde uygun bir yoğunluk gradyan ortamı ile karıştırın.

Şimdi, çok adımlı bir süreksiz yoğunluk gradyanı oluşturmak için önceden hazırlanmış ham çekirdek fraksiyonunun altında aynı gradyan ortamının artan yoğunluklarının katman çözümleri. Bu adım, ham çekirdek fraksiyonunun gradyanın tepesinde bir bant oluşturmasına izin verir.

Ardından, tüpü düşük bir hızda santrifüjleyin.

Şekil ve kütle farklılıklarına bağlı olarak, bozulmamış çekirdekler, enkaz ve nükleer parçalara kıyasla farklı şekilde göç eder. Bu, sağlam çekirdeklerin ayrı bir bant oluşturmasına neden olur.

Santrifüjlemeden sonra, yoğunluk gradyan çözeltilerinin arayüzünde bozulmamış çekirdeklerden oluşan farklı bandı bulun.

Bir pipet kullanarak, saf çekirdek bandına erişimi kolaylaştırmak için gradyanın üst katmanlarını aspire edin. Çekirdek içeren bandı yeni bir tüpe toplayın.

Bu çekirdekleri ışık mikroskobu altında görselleştirin. Sağlam çekirdekler, onları çevreleyen sağlam bir nükleer zar ile mükemmel bir şekilde yuvarlak görünür.

Son olarak, daha fazla analiz için saf nükleer fraksiyonu saklayın.

% 25 iyodiksanolün nihai konsantrasyonu için çekirdeğe 200 mikrolitre% 50 iyodiksanol çözeltisi ekleyin ve 300 mikrolitreye ayarlanmış pipet ile 10 kez karıştırın.

Ardından, katmanların karışmasını önlemek için P1000 ince uç kullanarak% 25'lik karışımın altına 300 mikrolitre %29 iyodiksanol çözeltisi ekleyin. P1000 ince uçlu %29'luk karışımın altına 300 mikrolitre %35 iyodiksanol çözeltisi ekleyin. Ardından yavaşça çıkarın.

Numuneleri sallanan bir kova santrifüjüne yerleştirin ve fren kapalıyken 4 santigrat derecede 3.500 x g'da 20 dakika döndürün.

Numuneleri sallamadan nazikçe çıkarın ve ışık altında gözlemleyin. İkinci ve üçüncü katman arasında %95 saf çekirdekten oluşan berrak beyaz bir bant görünür olmalıdır.

Çekirdekleri izole etmek için, arayüzdeki beyaz çekirdek bandını ortaya çıkarmak için üst katmanları aspire edin. Çekirdek bandını 200 mililitrelik bir hacimde toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Ardından 20 mikrometrelik bir filtre ile süzün.

Büyük döküntülerin çıkarıldığını ve nükleer zarın sağlamlığını doğrulamak için çekirdekleri ışık mikroskobu altında kontrol edin. Yuvarlak olmalılar ve nükleer zar bozulmamalıdır.