Ubikitinillenmiş Peptitlerin İmmünoaffinite Temelli Ekstraksiyonu: Ubikitin Etiketli Peptitleri Saflaştırılmış Peptit Fraksiyonlarından Seçici Olarak Ekstrakte Etmek İçin Bir Teknik

0 görüntüleme4:00 dk • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin ubikitinasyonu, di-glisin kalıntıları yoluyla substrat proteininin lizin kalıntılarına düzenleyici bir mini protein olan ubikuitinin eklenmesi ile karakterize edilir. Bu, substrat proteini ve ubikitin arasında bir lizin-glisin-glisin bağı oluşturur.

Ubikitin etiketli peptitleri izole etmek için, bir peptit karışımı alarak başlayın.

Bu peptitleri bir endonükleaz enzim kokteyli ile tedavi edin. Tedavi sırasında, Lys-C ve tripsin enzimleri, arginin kalıntısındaki ubikitinile peptitleri verimli bir şekilde parçalar ve bu da bir imza di-glisin motifi içeren peptit fragmanları ile sonuçlanır.

Bu peptit parçalarını, antikor konjuge hidrojel boncuklarından oluşan bir bulamaç haline getirin.

Bu antikorlar, yalnızca ubikitinile edilmiş peptitlere bağlanan ve bir peptit-boncuk kompleksi oluşturan bir di-glisin tanıma bölgesi içerir.

Ubikitinile edilmiş peptit-boncuk komplekslerini peletlemek için santrifüjleyin. Bağlanmamış ubikitinillenmiş olmayan peptit içeren süpernatanı çıkarın.

Kompleksleri bir filtre tertibatına yükleyin. Tamponu çıkarmak ve peptit konjuge boncukları yakalamak için santrifüjleyin.

PH'ı düşüren ve peptitlerin boncuklardan ayrılmasına neden olan asitleştirilmiş bir reaktif ekleyin.

Süzüntüden serbest peptitleri geri kazanın. Bunları hidrofobik matrisli yeni bir filtreye yükleyin. Asidik tuzlar yıkanırken peptitler matriste kalır.

Uygun bir çözücü kullanarak peptitleri ayırın.

Ubikitinile edilmiş peptitleri taze bir tüpe aktarın ve herhangi bir çözücü izini gidermek için kurutun.

Protein A agaroz boncuk bulamacına konjuge edilmiş bir ubikitin kalıntı motif antikoru partisi altı eşit fraksiyona bölünür. Üç peptit fraksiyonunu el yazması talimatlarına göre çözün ve kalıntıları aşağı doğru döndürün.

Üç fraksiyonun süpernatantlarını boncuk bulamacına ekleyin, diğer üç fraksiyonu buz üzerinde tutun ve bir döndürücü ünite üzerinde 4 santigrat derecede 2 saat inkübe edin.

Ardından boncukları aşağı doğru döndürün. Süpernatanı taze bir boncuk grubuna aktarın ve inkübasyonu kalan üç boncuk bulamaç fraksiyonu ile tekrarlayın.

Süpernatantları sonraki küresel proteom analizi için saklayın ve boncukları bir GF/F filtre tapası ile donatılmış 200 mikrolitrelik pipet uçlarına aktarın.

Uçları bir santrifüj ucu adaptörü ile donatılmış 1,5 mililitrelik tüplere koyun ve boncukları 200 mikrolitre buz gibi soğuk IAP tamponu ile üç kez yıkayın, ardından buz gibi soğuk arıtılmış suyla üç kez yıkayın.

Kolonları yıkamalar arasında 2 dakika boyunca 200 x g'da döndürün ve kolonun kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Son yıkamadan sonra, peptitleri 50 mikrolitre% 0.15 TFA'lık iki döngü ile elüte edin. Peptitleri bir C18 aşama ucu ile tuzdan arındırın ve vakumlu santrifüjleme ile kurutun.

10:50

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:28

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:03

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:00

Protein Ubikitinasyon Tespiti

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:09

Proteinler Peptid immunoaffiniti Zenginleştirme kullanarak Niceleme Kütle Spektrometresi ile birleştiğinde

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:37

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:12

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:54

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:26

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:33

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 1 Ağustos 2026