JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:00 dk. • April 30th, 2023
Proteinlerin ubikitinasyonu, di-glisin kalıntıları yoluyla substrat proteininin lizin kalıntılarına düzenleyici bir mini protein olan ubikuitinin eklenmesi ile karakterize edilir. Bu, substrat proteini ve ubikitin arasında bir lizin-glisin-glisin bağı oluşturur.
Ubikitin etiketli peptitleri izole etmek için, bir peptit karışımı alarak başlayın.
Bu peptitleri bir endonükleaz enzim kokteyli ile tedavi edin. Tedavi sırasında, Lys-C ve tripsin enzimleri, arginin kalıntısındaki ubikitinile peptitleri verimli bir şekilde parçalar ve bu da bir imza di-glisin motifi içeren peptit fragmanları ile sonuçlanır.
Bu peptit parçalarını, antikor konjuge hidrojel boncuklarından oluşan bir bulamaç haline getirin.
Bu antikorlar, yalnızca ubikitinile edilmiş peptitlere bağlanan ve bir peptit-boncuk kompleksi oluşturan bir di-glisin tanıma bölgesi içerir.
Ubikitinile edilmiş peptit-boncuk komplekslerini peletlemek için santrifüjleyin. Bağlanmamış ubikitinillenmiş olmayan peptit içeren süpernatanı çıkarın.
Kompleksleri bir filtre tertibatına yükleyin. Tamponu çıkarmak ve peptit konjuge boncukları yakalamak için santrifüjleyin.
PH'ı düşüren ve peptitlerin boncuklardan ayrılmasına neden olan asitleştirilm
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin