JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:22 dk. • April 30th, 2023
Başlamak için, sağlam hücre dışı veziküller veya EV'ler içeren bir tüp alın.
EV'leri istenen lizis tamponu hacminde askıya alın ve numuneyi sonikleştirin. Bu işlem, EV zarını parçalar ve genetik materyali keserek proteinleri tampona bırakır.
Hücre kalıntılarını ve kesilmiş genetik materyali peletlemek için santrifüjleyin. Çeşitli proteinler içeren süpernatanı toplayın.
Protein ekstraktına bir yükleme boyası ekleyin ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde çalıştırın.
Boya moleküllerinin proteinleri bağlamasına izin vermek için jeli bir boyama solüsyonuna batırın. İstenen proteini içeren lekeli bandı bulun ve eksize edin.
Sonraki adımlarda proteinlerin enzimlere erişilebilirliğini artırmak için renkli bandı küçük parçalar halinde kesin. Bu parçaları bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Leke boyasını çıkaran leke giderici bir solüsyon ekleyin. Harcanan leke giderme solüsyonunu çıkarın.
Bir azaltma çözümü ekleyin. İndirgeyici ajanın proteindeki disülfür bağlarını parçalamasına izin vermek için inkübe edin ve serbest sülfhidril gruplarını açığa çıkarın.
İndirgenmiş proteinleri alkilleyici bir çözelti ile tedavi edin. Alkil grupları, proteini katlanmamış halde tutarak serbest sülfhidril gruplarına bağlanır.
Fazla çözeltiyi atın ve alkilleyici reaktifi çıkarmak için parçaları bir dehidrasyon solüsyonu ile yıkayın. Jeli tamamen kurulayın.
Jel parçaları artık daha fazla proteomik analiz için hazırdır.
Protein ekstraksiyonu için, 50 mikrolitre RIPA tamponunu EV numunesi ile buz üzerinde 5 dakika karıştırın. Numuneyi 5 saniye boyunca 500 watt ve 20 kilohertz'de üç kez sonikleştirin. Ardından, 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyerek veziküler kalıntıları çıkarın.
Proteinleri izole ettikten sonra,% 12'lik bir poliakrilamid jelin istifleme jeli içinde protein göçü gerçekleştirin. Jeldeki proteinleri Coomassie mavisi ile oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin. Ardından, her renkli jel parçasını kesin ve küçük parçalar halinde kesin.
Jel parçalarını, el yazmasında anlatıldığı gibi bir dizi ardışık yıkamadan geçirin. Ardından, bir vakum yoğunlaştırıcı ile tamamen kurulayın. Kuruduktan sonra, 56 santigrat derecede 1 saat boyunca 10 milimolar ditiyotreitol içeren 100 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat ile protein azaltma işlemi yapın.
Daha sonra, karanlıkta 45 dakika boyunca 50 milimolar iyodoasetamid içeren 100 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat ile protein alkilasyonu gerçekleştirin. Jel parçalarını el yazması talimatlara göre yıkayın ve vakum yoğunlaştırıcıda tamamen kurutun.