Floresan Bazlı Transwell Makrofaj Çekim Testi: Kimyasal Kaynaklı Kemotaksis Yoluyla Tümör-Makrofaj Etkileşimini İncelemek İçin İn Vitro Bir Yöntem

Katı tümörler tarafından salınan bazı kimyasal cezbedici maddelere yanıt olarak, tümörle ilişkili makrofajlar veya TAM'lar gibi bağışıklık hücreleri katı tümörlere sızar. Daha sonra, bu TAM'lar tümör ilerlemesini kolaylaştırır.

TAM'lar ve tümör hücreleri arasındaki etkileşimleri in vitro olarak incelemek için, membranöz bir ek ile çok kuyulu bir plaka alarak başlayın. Bu düzenleme, kuyuyu geçici olarak iki bölmeye ayırır.

Daha sonra, transwell'in üst bölmesine bir TAM süspansiyonu ekleyin.

Transwell'in alt bölmesini, tümör hücreleri tarafından salgılanan kimyasal cezbedici maddelerle zenginleştirilmiş şartlandırılmış bir ortamla destekleyin.

Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, kimyasal modülatörler TAM'leri çeker. Bu, TAM'lerin kimyasal kaynaklı kemotaksis yoluyla gözenekli ek membran yoluyla alt bölmeye hareketine yol açar.

Şimdi, eki kuyudan çıkarın. Göçmen TAM popülasyonunu içeren şartlandırılmış ortamı floresan ölçümü için uygun bir plakaya aktarın.

Hücrelere floresan boya içeren bir lizis tamponu uygulayın. Bu tampon makrofajları parçalar. Sonunda, boya molekülleri nükleik asitlere bağlanarak gelişmiş bir floresan üretir.

Son olarak, bir floresan plaka okuyucusu kullanarak plakayı tarayın. Yüksek floresan, makrofajların kimyasal kaynaklı kemotaksis yoluyla başarılı bir şekilde göç ettiğini gösterir.

İlk önce gerekli malzemeleri oda sıcaklığına getirin. Her bir parçaya hazırlanan MV-4-11 hücrelerinden 250 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, şartlandırılmış ortam/ortamdan 400 mikrolitre yalnızca 24 oyuklu plakanın alt odalarına ekleyin ve numuneleri üç nüsha halinde eklediğinizden emin olun.

37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 4 saat inkübe edin. Ardından, aynı kuyunun iç duvarındaki ek parçaya hafifçe vurun ve eki atın. Karıştırmak için kuyucuklardaki hücreleri üç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.

Bu hücre süspansiyonunun 225 mikrolitresini, floresan ölçümü için uygun siyah duvarlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Bundan sonra, CyQuant boyasını 1:75 oranında 4x lizis tamponu ile seyreltin. Kısa bir süre girdap yapın ve çözeltiyi aşağı doğru döndürün.

Bu çözeltinin 75 mikrolitresini 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bir floresan plaka okuyucu kullanarak, floresansı okuyun ve verileri metin protokolünde belirtildiği gibi analiz edin.