JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 2:54 dk. • April 30th, 2023
Yapışık hücreler içeren çok kuyulu bir plaka alarak başlayın.
Bu hücreleri, timidinin radyoaktif bir versiyonu olan tritiatlı timidin içeren bir ortamla tedavi edin ve inkübe edin.
İnkübasyon sırasında, aktif olarak çoğalan hücreler radyoaktif timidin içerir. Bu timidin, adenozinin karşısına çıkar ve çoğalan hücrelerde radyoaktif işaretli DNA üretir.
Harcanan ortamı kuyulardan çıkarın. Hücreleri parçalamak için bir lizis tamponu ekleyin ve DNA'yı süspansiyona bırakın.
Biçerdöverin toplama tüplerini mikroplakanın kuyularının üzerine yerleştirerek hücre hasat makinesi tertibatını hazırlayın.
Kuyulardan askıya alınmış DNA'nın aspirasyonunu sağlamak için emme basıncı uygulayın. Bu DNA, filtre kağıdı üzerinde birikerek belirli noktalar oluşturur.
DNA lekeleri olan filtre kağıdı parçalarını kesin. Bu çarşafları ayrı ayrı parıldama şişelerine aktarın.
Filtre kağıdını bir parıldama kokteyli ile kaplayın. Şişeyi bir sıvı parıldama sayacına yerleştirin.
Tezgahın içinde, etiketli DNA radyoaktif bozunma yoluyla enerji yayar. Bu enerji, parıldama kokteylinin bileşenleri tarafından emilir. Sonunda, kokteyl bileşenleri darbeleri aktarmaya başlar ve bu da sensör tarafından emilir.
Tespit edilen radyoaktivite miktarı, hücre bölünmesinin derecesini belirler.
24 oyuklu bir plakada üç adet kuyucukta 100.000 hücre plakalayın. 46 saat sonra, kültür ortamına tritiye timidin ekleyin ve 2 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, ortamı çıkardıktan sonra, 300 mikrolitre önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri ayırmak ve DNA'yı serbest bırakmak için 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Ardından, hücre hasat makinesini çevirin ve pompayı çalıştırın.
Filtre kağıdını hücre hasat makinesine yerleştirin. Hücre hasat makinesinin tüplerini boş bir tepside toplamaya devam edin. Ardından, filtre kağıdını ıslatmak için ön yıkamaya basın. Toplama tüplerini numune kuyucuklarına yerleştirin ve başlayın.
Filtre kağıdını kurutmak için sıcak bir ışık kaynağı kullanın ve ilgili şişeleri tepsiye yerleştirin. Şişelere kağıt çatlakları delin ve ardından her şişeye 2 mililitre sıvı sintilasyon kokteyli ekleyin.
Aktif DNA sentezini yansıtan her numunenin dakika başına sayımını elde etmek için makineyi çalıştırmadan önce şişeleri sintilasyon sayacında 1 saat inkübe edin.