NPC Nörosfer Testi: Nörosferden Nöral Öncü Hücrelerin Göç Tepkisini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Test

Nörosferler, nöral öncü hücrelerin veya NPC'lerin yapışık olmayan küresel agregatlarıdır.

Spesifik yapışkan kültür koşulları altında kaplandığında, NPC'ler kendiliğinden nörosferden dışarı çıkabilir.

NPC'lerin göç tepkisini değerlendirmek için, önce uygun bir ortamda istenen yoğunlukta bir NPC süspansiyonu hazırlayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu ortam içeren bir kültür plakasına tohumlayın ve inkübe edin.

Ortamdaki spesifik büyüme faktörleri hücrelerin çoğalmasını destekler. Ek olarak, bir kaplama substratının olmaması, hücreleri ortamda asılı tutar ve nöroküre adı verilen 3D hücre agregatları oluşturmalarını kolaylaştırır.

İstenilen boyuta ulaştığınızda, nörosferleri toplayın.

Seyreltilmiş ortamda nörosfer peletini santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.

Daha sonra, nörosfer süspansiyonunu seyreltilmiş ortam içeren hücre dışı matris kaplı bir plakaya yerleştirin ve inkübe edin.

Kültür sırasında, nörosferler hücre dışı matrise yapışır.

Zamanla, hücre dışı matrisin bileşenleri nedeniyle, birkaç NPC nörosfer çekirdeğinden uzaklaşmaya başlar.

Şimdi, ortamı çıkarın ve hücreleri sabitleyin.

Hücre göçü sergileyen nörosferlerin faz kontrastlı görüntülerini yakalayın.

Uygun yazılımı kullanarak, toplam nörosferin alanını ve iç hücre kütlesini ölçün.

Son olarak, nörosferden ortalama NPC göçünü hesaplamak için iç hücre kütle alanını toplam nörosfer alanından çıkarın.

Nörosferi oluşturmak için, 1 mililitre %100 genleşme ortamını herhangi bir kaplama substratı olmadan 35 milimetrelik bir tabağa pipetleyin. Daha sonra, bu plakaların her birine bir milyon nöral öncü hücre ekleyin ve plakayı 48 ila 96 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plakayı nörosfer göçüne hazırlamak için, ECM taklitçi jel alikotlarını 6 mililitre% 30 genleşme ortamında çözün. 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğuna% 30 genleşme ortamı içeren 1 mililitre ECM taklit jeli ekleyin. Ardından, plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Nörosferleri kaplamak için, ortamdaki hücreleri 35 milimetrelik çanaktan toplamak ve bunları konik bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın. Ardından, nörosferleri peletlemek için tüpü 100 x g'da döndürün. Ardından, peleti 1 ila 3 mililitre önceden ısıtılmış %30 genleşme ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, 200 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş nöroküreleri, %30 genleşme ortamına sahip ECM mimik jeli içeren 6 oyuklu plakaya pipetleyin ve plakayı sallayın. Ardından, plakayı 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. ECM taklit jeli %30 genleşme ortamı ile aspire edin ve ardından hücreleri %4 paraformaldehit kullanarak 30 dakika sabitleyin.

Nörosferleri analiz etmek için 10X büyütmede faz kontrast ayarlarını kullanarak görüntüler yakalayın. Nörosferlerin ortalama göçünü ölçmek için NIH ImageJ yazılımını kullanın. ImageJ'de, nörosferin dış konturunu izlemek için serbest çizgi aracını kullanın.

Ardından, izleme alanını hesaplamak ve kürenin iç hücre kütlesini izlemek için ölçü işlevini kullanın. Ortalama göçü ölçmek için iç hücre kütlesini toplam nörosfer alanından çıkarın.