Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Astrosit in vitro kültür, en bol bulunan beyin hücreleri olan astrositlerin biyolojik rolünü araştırmaya yardımcı olur.

Diseksiyon mikroskobu altına yerleştirilmiş bir yenidoğan fare beyni ile başlayın.

Koku ampullerini ve beyinciği çıkarın.

Korteksi ayırmak için iki yarım küre arasında orta hat kesisi yapın.

Astrosit kültüründe fibroblastlardan ve meningeal hücrelerden kontaminasyonu önlemek için meninksleri çıkarın.

Korteks yarım kürelerini buz gibi soğuk bir ortama aktarın ve küçük parçalar halinde kıyın.

Kortikal parçaları tripsin içeren bir tüpte toplayın. Bir proteaz enzimi olan tripsin, hücre yapışma proteinlerini sindirerek hücre ayrışmasını kolaylaştırır.

Sindirilmiş dokuyu peletlemek için santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve pelete bir astrosit ortamı ekleyin. Astrositler, mikroglia ve oligodendrosit öncü hücreleri veya OPC'lerden oluşan karışık bir hücre popülasyonunu serbest bırakmak için kuvvetlice pipetleyin.

Bu hücre süspansiyonunu poli-lizin kaplı bir doku kültürü şişesine tohumlayın ve inkübe edin.

Negatif yüklü hücreler, pozitif yüklü poli-lizine bağlanır ve birleşik bir tabaka oluşturmak için tüm yüzey üzerinde büyür.

Gevşek bağlı mikroglia ve OPC'leri ayırmak için şişeyi sallayın. Ayrılmış hücreler içeren süpernatanı çıkarın.

Astrosit tabakasına tripsin ekleyin. Hücreleri toplayın ve santrifüjleyin.

Peletleri yeniden süspanse edin ve astrositleri birden fazla şişeye bölün.

Son olarak, hücreye özgü belirteçleri immün boyayarak astrosit kültürünün saflığını değerlendirin.

Beyinleri içeren çanağı bir stereomikroskoba aktarın. Daha sonra, korteksleri izole etmek için, her beynin arka ucunu ince forseps ile tutun ve hemisferler arasında orta hat insizyonu yapın.

Ardından, oluşturulan oluğa ikinci bir forseps seti yerleştirin ve korteksin plaka benzeri yapısını beynin geri kalanından soyun.

Tüm korteksler izole edildikten sonra, ince forsepslerle çekerek meninksleri korteksten dikkatlice soyun. Bu adım, son astrosit kültürünün meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından kontaminasyonunu önler.

Hazırlanan kortikal hemisferleri soğutulmuş HBSS ile doldurulmuş ikinci bir tabağa aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Dört korteksin tümü ile buna göre devam edin. Son olarak, her yarım küreyi keskin bıçaklar kullanarak dört ila sekiz küçük parçaya bölün.

Steril koşullar altında, korteks parçalarını 50 mililitrelik bir Falcon tüpüne aktarın ve 22.5 mililitrelik bir nihai hacme HBSS ekleyin. Ardından, 2,5 mililitre% 2,5 tripsin ekleyin.

Kapağı değiştirin, karıştırın ve dokuyu su banyosunda 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir çalkalayarak karıştırın. Daha sonra, korteks doku parçalarını peletlemek için 300 x g'da 5 dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı dikkatlice boşaltın.

Pelete 10 mililitre astrosit kaplama ortamı ekleyin ve dokuyu içeren ortamı tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar 20 ila 30 kez yukarı ve aşağı kuvvetlice pipetlemek için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.

Daha sonra, 20 mililitrelik bir son hacme astrosit kaplama ortamı ekleyin ve standart prosedürlere göre bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.

Dört fare yavrusu korteksinden oluşan bir preparasyon, 10 ila 15 kez, 10 ila altıncı ayrışmış tek hücre vermelidir. Son olarak, poli-D-lizini önceden hazırlanmış bir şişeden aspire edin ve ayrışmış hücre süspansiyonunu şişeye aktarın.

Kültürü doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 2 gün inkübe edin ve ardından ortamı değiştirin. Medya daha sonra her 3 günde bir değiştirilmelidir.

Astrosit, kültürde 7 ila 8 gün sonra üstteki bir mikroglia tabakası ile birleşmiş görünmelidir. Bu noktada, mikroglia'yı çıkarmak için T75 şişesini 30 dakika boyunca dakikada 180 dönüşe ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya ayarlayın.

Mikroglia içeren süpernatanı atın veya döndürün ve kültür için plakalayın. Daha sonra 20 mililitre taze astrosit kültür ortamı ekleyin ve oligodendrosit öncü hücrelerini çıkarmak için şişeyi 240 rpm'de 6 saat çalkalayarak devam edin.

Bazı OPC'ler astrosit tabakasından tamamen ayrılmayacağı için OPC kontaminasyonunu önlemek için 1 dakika boyunca el ile kuvvetlice çalkalamaya devam edin. Yine, süpernatanı atın veya OPC'leri kültürlemek için bir plaka üzerinde döndürün.

Kalan birleşik astrosit tabakasını PBS ile iki kez durulayın. PBS'yi aspire edin ve 5 mililitre tripsin-EDTA ekleyin. Doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.

Her 5 dakikada bir astrositlerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin ve şişeyi avucunuzun içine iki ila üç kez vurarak astrositlerin ayrılmasını sağlayın.

Astrositler şişeden ayrıldıktan sonra, 5 mililitre astrosit kültür ortamı ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 180 x g'da döndürün, süpernatanı aspire edin ve 40 mililitre taze astrosit kaplama ortamı ekleyin.

Karışık kortikal hücrelerden oluşan bir T75 şişesi, ilk geçişten sonra astrositler için zenginleştirilmiş altıncı hücrelere yaklaşık 1 kez 10 vermelidir.