JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 8:27 dk. • April 30th, 2023
Beyin endotel hücrelerini izole etmek için, önce hasat edilmiş bir sıçan beynini soğutulmuş tampon içeren bir tabağa aktarın.
Beyincik ve optik sinirleri çıkardıktan sonra beyni serebral hemisferlere bölün. Ardından, orta beyni ön beyinden ayırın.
Meninksleri ve miyelin içeren beyaz maddeyi ön beyinden çıkarın, mikrodamarları izole etmek için beyin korteksini geride bırakın.
Ardından, sinir dokusunu ve bileşenlerini kırmak için korteksi homojenize edin.
Hücresel kalıntıları ve miyelini gidermek için homojenatı santrifüjleyin.
Daha sonra, doku peletini kollajenaz, dispas ve deoksiribonükleaz enzimleri içeren bir sindirim kokteyli ile tedavi edin.
Kollajenazlar ve dispaslar, mikrodamarları gömen hücre dışı matrisi sindirir ve mikrodamar parçalarını dokudan gevşetir. Deoksiribonükleazlar, parçalanmış hücrelerden salınan herhangi bir serbest DNA'yı bozar.
İstenilen hacimde sindirilmiş homojenatı uygun yoğunluk gradyan ortamı ve santrifüj ile karıştırın.
Miyelin ve beyin parankimal hücre içeren en üst tabakayı ve ardından süpernatanı atın.
Şimdi, endotel hücreleri ve perisitleri içeren mikro damar parçalarını tamamen serbest bırakmak için mikro damar içeren peleti sindirim kokteyli ile muamele edin.
Süspansiyonu santrifüjleyin. Mikrodamar parçası içeren peleti, bir antibiyotik olan puromisin ile takviye edilmiş uygun bir ortamda yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu hücre dışı matriks proteini kaplı bir plakaya tohumlayın ve inkübe edin.
Mikro damar parçaları plakadaki kaplamaya yapışır. Puromisin perisitleri seçici olarak ortadan kaldırırken, medya bileşenleri endotel hücrelerinin proliferasyonunu kolaylaştırır.
Beyni, 5 haftalık üç Wistar faresinin kafatasından çıkarın ve beyinleri, buz üzerinde tutulan soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.
Beyincik ve optik sinirler olmadan beyinleri inceleyin. Ardından, iki serebral hemisferi ayırmak için her bir beyni ikiye bölün.
Stereomikroskop altında, orta beyni çıkarmak için başka bir kesim yapın ve tüm ön beyinleri diseksiyon tamponu ile buz üzerinde temiz bir Petri kabına aktarın.
Ardından, bir ön beyni soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulmuş yeni bir Petri kabına aktarın. Kelepçe ile tutun ve meninksleri ön beynin kenarlarından dikkatlice çıkarın.
Daha sonra, ön beyni ters çevirin ve meninksleri yırtmadan dikkatlice çekin. Ön beynin meninkslerden arındırıldığından emin olun ve optik sinirlerin kalan kısmını kesin. Bu adımın amacı, bir korteks kabuğu elde etmek için beyaz madde yorganını çıkarmaktır.
Ön beyni kenardan sıkıştırarak başlayın ve ardından korteksin yüzeyini yırtmamaya dikkat ederek forsepsleri yüzey boyunca dikkatlice sürükleyin.
Ardından, artık meninksler veya büyük yüzey damarları olmadığını kontrol etmek için beynin yuvarlanarak meninkslerden arınmış olduğundan emin olun.
Daha sonra, üç beynin kafatasından çıkarılmasıyla başlayarak, doku koruması ve hücre sağkalımı için diseksiyon için tam süre 2 saatten fazla sürmemelidir. Üç beynin kortekslerini 7 mililitrelik bir Dounce homojenizatörde 6 mililitre soğuk diseksiyon tamponuna aktarın.
Daha sonra, korteksleri daha büyük açıklığa sahip ilk havaneli ile 10 yukarı ve aşağı vuruşla, ardından daha küçük boşluklu ikinci havaneli ile 10 yukarı ve aşağı vuruşla ayırın.
Ardından, 6 mililitre süspansiyonu 50 mililitrelik yeni bir Falcon tüpüne aktarın ve Dounce homojenizatörü 24 mililitre soğuk diseksiyon tamponu ile yıkayın. Tüp başına bir korteks eşdeğerini elde etmek için süspansiyonu üç Falcon tüpüne bölün.
Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleyin. Peletin gözlemlenmesi, kortekslerin homojenatının mikro damar kısmını temsil eden pembe renkte bir gradyan gösterir.
Şimdi, süpernatanı atın ve peleti bir korteksten kollajenaz, dispas, DNaz tip 1 ve gentamisin karışımı içeren 1 mililitre enzimatik çözelti ile homojenize edin.
Tüpleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin. Ardından, 1 mililitre sindirimi 10 mililitre %25 BSA/HBSS 1X ile karıştırın ve tüpleri nazikçe girdaplayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.600 x g'da yoğunluğa bağlı santrifüjleme ile ayırın.
Yoğunluğa bağlı santrifüjlemeden sonra, pelet mikro damarları içerir ve üst disk miyelin, beyin parankimi ve artık mikro damarları içerir.
Üst diski ve süpernatanı dikkatlice temiz 50 mililitrelik Falcon tüplerine aktarın; mikro damar peletini aspire etmemeye dikkat edin.
Tüpü nazikçe girdaplayın ve yoğunluğa bağlı santrifüjlemeyi tekrarlayın. Bu ikinci santrifüjleme sırasında, mikro damarları içeren elde edilen peleti 4 santigrat derecede tutun.
İkinci yoğunluğa bağlı santrifüjlemeden sonra, üst diski ve süpernatanı dikkatlice atın. Her iki santrifüjden elde edilen mikro damarları içeren elde edilen peletleri 1 mililitre soğuk HBSS 1X ile karıştırın ve yeniden süspanse edin.
Daha sonra, mikro damarları 20 mililitre soğuk HBSS 1X ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, mikro damar peletini kaybetmemeye dikkat ederek süpernatanı atın.
Tüplerin hafif bir girdabını takiben mikrodamar peletini bir korteksten 1 mililitre aynı enzimatik çözelti ile homojenize edin. Ayrıca, mikro damarları bir çalkalayıcıda 37 santigrat derecede 1 saat boyunca sindirin. Bundan sonra, üç korteksten sindirilmiş mikro damarları bir tüpe karıştırın.
Yine, tüp başına bir buçuk korteks eşdeğerinden ekstrakte edilen mikro damarları elde etmek için karışımı iki adet 50 mililitrelik Falcon tüpüne ayırın. Ardından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
Mikro kapları kaplamadan hemen önce, inkübatörden iki kaplanmış T75 şişesi alın ve kaplamanın fazlalığını aspire edin. Süpernatanı atın ve mikro damar peletini 1 mililitre ECM'de yeniden süspanse edin.
Saflaştırma işlemini başlatmak için mililitre başına 4 mikrogram puromisin ile desteklenmiş ECM ile her tüpü 10 mililitreye getirin ve mikro damarları şişeye yerleştirin.
Daha sonra, kollajen-fibronektin matrisine mikro damar yapışmasını sağlamak için şişeleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöre koyun.