Zebra Balığı Larvalarından Beyin Hücresi İzolasyonu: Zebra Balığı Beyin Dokusundan Sağlam Nöronlar, Makrofajlar ve Mikroglia Elde Etme Tekniği

Zebra balığı beyni, bilginin işlenmesinde önemli bir rol oynayan sinir hücreleri olan nöronlardan oluşur. Ek olarak, nöronlar arası boşlukta yaşayan makrofajlar ve mikroglia dahil olmak üzere destekleyici bağışıklık hücrelerinin bir popülasyonunu içerir.

Tüm bu tür beyin hücrelerini bir zebra balığından izole etmek için, önce anestezi uygulanmış zebra balığı larvalarını uygun ortam içeren bir Petri kabına alın.

Zebra balığını stereomikroskop altında görselleştirin ve beyni sağlam tutmak için larva başlarını yumurta sarısı kesesinin üzerine geçirin.

Eksize edilen başlıkları, buz üzerine yerleştirilmiş, önceden soğutulmuş ortamla doldurulmuş bir homojenizatöre aktarın. Düşük sıcaklık, beyin hücrelerinin bozulmasını önlemeye yardımcı olur.

Bir havaneli ile zebra balığı beyin dokusunu homojenize edin. Homojenizasyon, hücre dışı matrisi parçalar ve nöronların, makrofajların ve mikrogliaların beyin dokusundan ayrışmasını başlatır.

Bu adım aynı zamanda lipit açısından zengin bir yalıtım tabakası olan miyelini nöronlardan ayırır.

Büyük hücre kümelerini hapsetmek için homojenatı bir süzgeçten geçirin.

Hücreleri ve miyelin kılıf parçalarını peletlemek için süzüntüyü santrifüjleyin. Kalıntı içeren süpernatanı atın.

Peleti uygun yoğunlukta gradyan bir ortamda yeniden süspanse edin ve bir tampon ile kaplayın.

Tüpü düşük hızda döndürün. Daha hafif miyelin fragmanları, tampon ve yoğunluk gradyan ortamının arayüzünde ayrı bir bant oluştururken, daha yoğun hücreler dibe çöker.

Üst katmanları aspire edin ve daha fazla kullanım için beyin hücrelerini taze ortamda yeniden süspanse edin.

Anestezi hazırlamak için 50 larvaya 50 mililitre orta başına 1,5 mililitre 15 milimolar Trikain ekleyin. Daha sonra, bir seferde 10 larvayı terminal anestezik hale getirmek için Trikain içeren buz gibi soğuk E3 ortamı ile doldurulmuş 55 milimetrelik bir Petri kabına aktarmak için 3 mililitrelik bir Pasteur pipeti kullanın.

Stereomikroskop altında, Petri kabının ortasına 10 larva hizalayın. Daha sonra, cerrahi makas kullanarak, larva başlarını yumurta sarısı kesesinin üzerine geçirin.

3 mililitrelik bir Pasteur pipeti ile tüm kafaları alın ve mümkün olduğunca az sıvı ile 1 mililitre buz gibi soğuk Medya A içeren buz üzerindeki bir cam homojenizatöre aktarın.

Buz gibi soğuk E3 artı Trikain içeren her küçük Petri kabını, transeksiyonun soğuk E3 artı Trikain ortamında yapıldığından emin olmak için her 30 dakikada bir yenisiyle değiştirin.

Renk solmaya başladığında cam homojenizatördeki buz gibi Ortam A'yı değiştirin. Tüm başlık grubu toplandıktan sonra, tüm Ortam A'yı cam homojenizatörden çıkarın ve 1 mililitre taze buz gibi soğuk Ortam A ile değiştirin.

Homojenizatör hala buz üzerindeyken, 3 ila 5 dpf larvaları için 40 tur kırma ve dönüş ve 7 ve 8 dpf larvaları için 50 tur gerçekleştirerek beyin dokusunu bozmak için sıkı oturan bir havaneli kullanın.

Ardından, hücreleri seyreltmek ve miyelin ile aglomerasyonlarını azaltmak için hücre süspansiyonuna 2 mililitre Ortam A ekleyin. Hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde 50 mililitrelik soğuk bir şahin tüpüne geçirerek hücre aglomerasyonunu ortadan kaldırın. Bu adımı üç kez tekrarlayın.

1 mililitrelik hücre süspansiyonu alikotunu soğuk 1.5 milimetrelik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 300 x g ve 4 santigrat derecede döndürün. Ardından, 23G x 1" iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak süpernatanı çıkarın.

1 mililitre buz gibi %22 yoğunluk gradyan ortamı ile, 0,5 mililitre buz gibi soğuk 1x DPBS ile nazikçe kaplı, hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Tüpleri ara vermeden 950 x g'de döndürün ve 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede yavaş ivmelendirin.

Döndürmeden sonra, arayüzde sıkışan DPBS yoğunluk gradyan ortamını ve miyelini atın. Ardından, hücreleri yıkamak için %2 NGS'li 0,5 milimetre Ortam A kullanın ve tüpleri 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede 300 x g'da döndürün.

Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı çıkarın, ardından hücre peletlerini aynı deneysel koşuldan %2 NGS ile 1 mililitre Ortam A'da birlikte çekin.

İlgilenilen hücreler bir floresan proteini ifade ediyorsa, hücre süspansiyonunu 35 mikronluk bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve bunları ışıktan korunan buz üzerindeki soğuk 5 mililitrelik FACS tüplerine aktarın.