Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden (PBMNC'ler) İndüklenmiş Nöral Kök Hücrelerin (iNSC'ler) Üretilmesi: PBMNC'leri iNSC'lere Yeniden Programlamak için Sendai Virüsü Tabanlı Bir Prosedür

Somatik hücreleri indüklenmiş nöral kök hücrelere veya iNSC'lere yeniden programlamak için - yüksek kendini yenileme ve farklılaşma kabiliyetine sahip kök hücreler, eritroblastları genişletmek için periferik kan mononükleer hücrelerini serumsuz bir ortamda kültürleyerek başlayın.

Daha sonra, eritroplast süspansiyonunu bir kültür plakasına pipetleyin. Hücreleri rekombinant Sendai virüsü veya SeV ile tedavi edin. Bu virüsler yeniden programlama transkripsiyon faktörlerini kodlar. Hücreleri çökeltmek ve inkübe etmek için santrifüjleyin.

Konak hücre zarına SeV füzyonunu takiben, virüs genomu transkripsiyona ve ardından sitoplazmada translasyona uğrar. Transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonu, genleri konakçı genomuna entegre etmeden hücre yeniden programlama sürecini tetikler.

Şimdi, virüsleri uzaklaştırmak için kültürü santrifüjleyin. Dönüştürülen hücreleri uygun bir ortamda yeniden süspanse edin, ardından kaplama yapın. Ayrıca, hücresel kalıntıları gidermek için santrifüjleyin. iNSC ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.

Daha sonra, hücreleri protein kaplı bir plakaya tohumlayın. Hücreler plakadaki protein kaplamasına yapışır. Yapışan hücreleri alternatif günlerde iNSC ortamı ile destekleyin. Bir haftalık kültürden sonra, harcanan medyayı günlük olarak yeni iNSC medyasıyla değiştirin.

Ortamdaki büyüme faktörleri ve kimyasal bileşenler, kendini yenilemeyi sürdürür ve transdüksiyona uğrayan hücrelerin bir alt kümesinin pluripotentliğini destekler ve onları tamamen iNSC'lere yeniden programlar. Zamanla, hücreler iNSC kolonileri oluşturmaya başlar. Kültür için istediğiniz kolonileri seçin.

0. günde, hücreleri MNC ortamında toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mililitre önceden ısıtılmış MNC ortamı ile yeniden süspanse edin. Canlı hücreleri Tripan Mavisi ile sayın ve daha sonra önceden ısıtılmış MNC ortamı ile 24 oyuklu plakalarda kuyu başına 200.000 hücre konsantrasyonuna kadar yeniden süspanse edin.

Sendai virüsü içeren eksi 80 santigrat derece depodan çıkarılan tüpleri 37 santigrat derece su banyosunda 5 ila 10 saniye çözdürün ve ardından oda sıcaklığında çözülmeye bırakın. Çözüldükten sonra hemen buzun üzerine koyun. Çözülmüş Sendai virüsünü, 10'luk bir enfeksiyon çokluğunda ÇUŞ'larla 24 oyuklu plakanın kuyularına ekleyin. Hücrelerin bağlanmasını kolaylaştırmak için, plakaları 30 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin ve bundan sonra plakaları 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin.

1. günde, ortamdaki hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Kalan hücreleri daha fazla ayırmak için, kuyucukları oyuk başına 1 mililitre MNC ortamı ile durulayın ve ortamı olan hücreleri tüpe ekleyin. Bu hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire edin, hücreleri 500 mikrolitre taze önceden ısıtılmış MNC ortamı ile yeniden süspanse edin ve 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna ekleyin.

2. günde, oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca 6 oyuklu plakaları kaplamak için mikrolitre poli-D-lizin ve D-PBS başına önceden seyreltilmiş 50 mikrogram kuyu başına 1 mililitre kullanın. 6 oyuklu plakalardan poli-D-lizin aspire edin ve dikey temiz tezgahta yaklaşık 10 dakika kurutun. Daha sonra, 6 oyuklu plakalara mililitre başına 5 mikrogram önceden seyreltilmiş bir lamininin oyuklu başına 1 mililitre ekleyin ve kaplamak için 37 santigrat derecede 4 ila 6 saat inkübe edin. Kullanmadan önce plakaları D-PBS ile yıkayın.

3. günde, tüm Sendai virüsü transdüksiyonlu MNC'leri indüklenmiş nöral kök hücre ortamında poli-D-lizin laminin kaplı 6 oyuklu plakalar üzerine plakalayın. 5. ve 7. günlerde, 6 oyuklu plakaların her bir oyuğuna 1 mililitre 37 santigrat derece önceden ısıtılmış iNSC ortamını nazikçe ekleyin.

9. günden 28. güne kadar, ortamı her gün önceden ısıtılmış taze iNSC ortamıyla değiştirin. iNSC kolonilerinin ortaya çıkışını izleyin ve yaklaşık 2 ila 3 hafta içinde yanmış cam pipetler kullanarak uygun morfolojiye sahip kolonileri toplayın. Daha sonra, genişleme için her koloniyi 6 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyusuna aktarın.