Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 4:07 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR teknolojisi, tek bir PCR reaksiyonunun reaktanları milyonlarca nanodamlacık PCR reaksiyonuna böler. Bu kütle bölünmesi ve ardından amplifikasyon, vahşi tip DNA'nın geniş bir arka planına karşı çok az miktarda mutant DNA'yı tespit ederek erken kanser tespitini mümkün kılar.

Başlamak için, diğer PCR reaktifleri ve bir damlacık stabilize edici yağ ile birlikte floresan etiketli oligonükleotidler içeren dPCR ana karışımını aspire edin. Hava kabarcıklarını önlemek için bu ana karışımı doğrudan bir PCR şerit tüpündeki her bir kuyucuğun dibine ekleyin. Ardından, reaksiyon karışımına DNA örnekleri ekleyin ve karıştırmak için birden çok kez pipetleyin.

Şimdi, tüm reaksiyon karışımını damlacık üreten bir cihazın özel bir çipine aktarın. Damlacık üreten cihaza yeni bir PCR şerit tüpü monte edin. Damlacık üreteci, damlacıklar arasında çapraz kontaminasyonu önleyen kapsüllenmiş bir alana sahip ayrı nanodamlacıklar oluşturmak için numuneyi ve yağı birleştirir.

Damlacıklama tamamlandıktan sonra, hedef DNA'yı amplifiye etmek için PCR şerit tüpünü bir termal döngüleyiciye aktarın. Ardından, PCR ürününü, floresan pozitif ve negatif damlacıkları sayan bir floresan dedektörü içeren bir damlacık okuyucusuna yükleyin. Pozitif damlacıkların sayısı, numunedeki hedef DNA konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılabilir.

Damlacık dijital PCR prosedürüne başlamadan önce, tezgah alanını ve ekipmanı %10 ağartıcı ve %70 etanol ile temizleyin ve damlacık stabilize edici yağ dışındaki tüm reaktifleri nazikçe girdaplayın ve kısaca santrifüjleyin. Sıkıştırılmış nitrojen gazı silindirinin damlacık üreten cihaza bağlı olduğunu ve silindir tankının inç kare başına 90 pound olarak ayarlandığını onaylayın. 38 mikrolitre dijital PCR reaksiyon karışımını doğrudan 8 oyuklu bir PCR tüp şeridinin her bir oyuğunun dibine ekleyin ve temiz bir pipet ucuyla kabarcıkları çıkarın.

12 mikrolitre önceden çoğaltılmış DNA örneğini tüp şeridinin uygun kuyucuklarına üç kopya halinde ekleyin. Reaksiyon karışımını DNA numunesi ile karıştırmak için tam hacmi 10 kez nazikçe pipetleyin ve her bir oyuktan tam hacmi damlacık üreten bir alet çipinin karşılık gelen A ila H kanallarına pipetleyin. Damlacık üreten cihaza yeni bir PCR tüp şeridi yerleştirin ve damlacık üreten cihaz çipi kimliğini cihaz bilgisayarındaki yazılıma tarayın.

Ardından, numuneleri damlatmaya başlamak için "Çalıştırmayı başlat"a tıklayın. Damlacık tamamlandığında, PCR tüp şeridini çıkarın ve tüp şeridi kapaklarını uygulayın. Tüp şeridini bir termal döngüleyiciye aktarın ve tüpü kuyucuk başına 80 mikrolitre su içeren başka bir tüp şeridi ile dengeleyin. Ardından, termal döngüleyiciyi uygun termal döngü koşulları altında çalıştırın. Şerit kapakları yüksek hızlı kapaklarla değiştirin.

Termal döngü tamamlandığında, tüp şeridini miktar tayin cihazına aktarın. Cihaz yazılımında "Bir çalıştırma ayarla"ya tıklayın ve tüp şeridini miktar belirleme cihazına yerleştirin. Metal kalkanı yeni bir niceleme cihazı çipinin üzerine yerleştirin. Çip kimliğini cihaza tarayın ve çipi makineye yerleştirin. Enstrümanın kapağını kapatın. Bilgisayar yazılımında, dijital PCR çalıştırması ve sekiz kanalın her biri için bir ad girin. Ardından, "Hızlı mod"u seçin ve nicelemeye başlamak için "Başlat"a tıklayın.

10:16

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:23

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:25

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:34

Hedef Genlerde Indel Mutasyonu Tespiti için Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:28

Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:50

Nanoakışkan bir çip kullanarak nadir transkript varyantlarını tespit etmek için çip tabanlı dijital PCR

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:37

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:16

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:58

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:53

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 22 Ağustos 2026