MSC Tohumlu İskele Hazırlığı: Mezenkimal Kök Hücrelerle Tohumlanmış İskeleyi Murin Modeline Cerrahi İmplantasyon İçin Hazırlama Tekniği

Kanser hücreleri, mezenkimal kök hücreleri veya MSC'leri kan damarlarından tümör konumuna çekmek için kemotaktik hedef bulma faktörleri üretir.

Bu hücrelerin in vitro tümör büyümesi üzerindeki etkisini incelemek için, sterilize edilmiş bir iskele substratı alarak başlayın. İskeleyi önceden ıslatmak için istenen ortamı içeren bir kuyu plakasına aktarın. Daha iyi hücre yapışması için iskeleye yapışan fazla ortamı çıkarmak için kuru bir yüzeye yerleştirin. Kısmen kurutulmuş iskeleyi taze bir kuyuya aktarın. İskeleye bir damla MSC süspansiyonu damlatın.

Ek olarak, sonraki inkübasyon sırasında ortamın damladan buharlaşmasını önleyen bir hidrasyon odası oluşturmak için kuyunun köşelerine daha fazla ortam ekleyin. MSC'lerin iskele yüzeyine yapışmasını sağlamak için inkübe edin. Tohumlanmamış yüzeyi ortaya çıkarmak için iskeleyi ters çevirin. Bu tarafa yeni bir damla MSC süspansiyonu pipetleyin ve MSC'lerin yapışmasına izin verin.

MSC'ler iskelenin her iki tarafına da yapıştıktan sonra, tüm hücrelerin ortamla temas halinde olduğundan emin olmak için daha fazla ortamla örtün. MSC'ler büyüyene ve iskelenin aralıklarına ve gözeneklerine sızana kadar kuluçkaya yatırın. MSC tohumlu iskele cerrahi implantasyon için hazırdır.

Farelerde implantasyondan 48 saat önce, önce PLA iskelelerini yaklaşık 2 x 2 milimetrelik rezeksiyon boşluğu büyüklüğünde parçalar halinde keserek iskeleleri hazırlayın. İskeleleri 15 dakika boyunca %70 etanole batırarak sterilize edin. 15 dakika sonra iskeleleri PBS'ye daldırın. Ardından, hücreleri tohumlama için hazırlarken iskeleleri %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'una yerleştirin.

Hücreleri hazırlamak için önce %0.05 tripsin kullanarak kültürlenmiş MSC'leri kaldırın. 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından hücrelerin kalktığından emin olun. Ardından, tripsini etkisiz hale getirmek için şişeye DMEM ekleyin. Ardından, şişe içeriğini 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme yoluyla her iskele için 5 kez 10 ila beşinci MSC'leri peletleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve MSC'leri 5 kere 10 ila beşinci hücrelere 5 mikrolitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Ardından, forseps ile DMEM daldırmasından bir iskele çıkarın ve 6 oyuklu plakanın kapağına yerleştirin. İskeleyi kapaktan kaldırın ve geride bir damla fazla DMEM bırakın. İskeleyi tekrar kapağın üzerine yeni, kuru bir yere yerleştirin. Üç ila beş kez tekrarlayın. Ardından, kısmen kurutulmuş iskeleyi tohumlama için 6 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin.

Kısmen kurutulmuş bir iskele, optimum hücre tohumlama sonuçları sağlar. İskele çok ıslaksa, hücreler iskeleden kayacak ve aşağıdaki plakaya yapışacaktır. İskele kurursa, damlacık tüm iskeleye yayılmayacak ve bu da zayıf ilk hücre dağılımına neden olacaktır.

Bir pipet kullanarak, bazı hücreler dibe çökmüş olabileceğinden, süspansiyonu homojenize etmek için MSC tüpünü hafifçe karıştırın. 2,5 mikrolitre taze karıştırılmış MSC süspansiyonunu doğrudan iskelenin üzerine yavaşça pipetleyin ve iskelenin üstünde küçük bir damlacık oluşturun. Hücre damlacığının hızlı buharlaşmasını önlemek için her kuyucuğun kenarlarına 300 mikrolitre DMEM ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve hücrelerin iskeleye yapışmasına izin verin.

Kuluçkayı takiben, iskeleleri kuyu plakasında nazikçe ters çevirmek için forseps kullanın. 2.5 mikrolitre taze karıştırılmış MSC süspansiyonunu tohumlayın, böylece iskele başına ekilen beşinci hücrelere toplam 5 kez 10 verin. Hücrelerin iskeleye yapışmasını sağlamak için 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 2 mililitre ekleyerek iskeleleri DMEM'de örtün. Ortamın altlarından akmasına izin vermek için iskeleleri yavaşça kaldırın. İmplantasyon ameliyatından önce 48 saat boyunca bu durumda 37 santigrat derecede inkübe edin.