JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:06 dk • July 8th, 2025
Mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler, apoptozu indükleyen tümör hücreleri üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanan tümör nekroz faktörü ile ilişkili apoptoza neden olan ligand veya TRAIL'i eksprese etmek için genetik olarak tasarlanabilir.
Bu MSC'leri tümör taşıyan bir fare modeline iletmek için, önce TRAIL eksprese eden bir MSC tohumlu biyopolimer iskele hazırlayın. Daha sonra, floresan etiketli beyin tümörü taşıyan anestezi uygulanmış bir fareyi stereotaktik bir çerçeveye sabitleyin. Farenin beyne erişmek için önceden belirlenmiş bir kafatası penceresi vardır.
Bir ısıtma yastığı ile farenin vücut ısısını koruyun. Ameliyat bölgesini sterilize edin ve kafa derisinde orta hat kesisi yapın. Kraniyal pencereyi ortaya çıkarmak için deri altı yağını çıkarın. Dura mater'i pencereden soyun, altta yatan parankimal dokuyu ve tümörü açığa çıkarın.
Şimdi, bir floresan stereomikroskop altında, floresan tümörü görselleştirin. Floresan tümör dokusunu beyinden aspire edin. Fizyolojik pH'ı eski haline getirmek için tuzlu su ile yıkayın. MSC tohumlu iskeleyi rezeksiyon boşluğuna implante edin. İskeleyi yerine sabitlemek için uygun bir hemostatik ajan uygulayın. Kesiği kapatın ve farenin iyileşmesine izin verin.
İmplantasyonu takiben, rezidüel tümör odakları içindeki tümör hücreleri, MSC'lerin iskeleden tümör hücrelerine doğru göçünü kolaylaştıran çözünür faktörler salgılar. MSC'ler tarafından salgılanan TRAIL proteinleri, tümör hücreleri üzerindeki spesifik reseptörlere bağlanarak apoptotik hücre ölümüne neden olur.
Stereotaksik çerçeveyi bir floresan diseksiyon stereomikroskobunun sahnesine yerleştirerek başlayın. Ardından, anestezi uygulanmış fareyi bir izofluran burun konisi adaptörü aracılığıyla sürekli inhale anestezi beslemesi ile stereotaksik çerçeve üzerine sabitleyin. Bir ısıtma yastığı ile vücut ısısını koruyun. Korneanın kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün. Ardından, kafa derisinin kesi bölgesini bir dizi üç alkol ve üç betadin mendil ile sterilize edin.
Her uzuvda ayak parmağı kıstırma refleks testini yapın ve uygun anesteziyi sağlamak için negatif yanıtı onaylayın. Forseps kullanarak kafa derisini sıkıştırın ve nazikçe kaldırın. Cerrahi makasla orta hat lineer rostral-kaudal kesi yaptıktan sonra, kesi bölgesini PBS ile yıkayın ve dairesel fırçalama hareketiyle pamuk uçlu aplikatör ile deri altı yağını alın.
Cildi, önceden kurulmuş olan kraniyal pencere tamamen görünür olacak şekilde düzenleyin. Dura'yı kafatası penceresinin sınırlarına kadar nazikçe delmek için 18 gauge bir iğne kullanın. Kesi pencerenin içini tamamen izleyene kadar tekrarlayın. Durayı, altta yatan parankimi ve tümörü ortaya çıkaran ince forseps kullanarak soyarak çıkarın.
Ardından, oda ışıklarını kısın ve stereomikroskop floresan modunu açın. U87 mCherry ve ateşböceği lusiferaz eksprese eden tümörü bulun. Bir vakum pompasının hortumunun ucuna 200 mikrolitrelik bir pipet ucu yükleyin. Ardından vakum pompasını açın. Hiçbir sinyal kalmayana kadar floresan dokuyu nazikçe aspire ederek tümörü rezeke edin. Kanamayı kontrol etmek için soğuk PBS ile sulama yapın ve pamuk uçlu bir aplikatör ile sabit basınç uygulayın.
İskeleyi implante etmeden önce kanamayı durdurmak için tuzlu su, pamuk uçlu aplikatör ile sabit basınç ve/veya SURGICEL gibi hemostatik bir ajan kombinasyonu kullanın. Düzgün bir şekilde kontrol edilmezse, potansiyel olarak tehlikeli bir hematom oluşabilir. Rezeksiyondan sonra vakum pompasını kapatın ve pipet ucunu atın. Floresansı kapatın ve oda tekrar yanar. İmplantasyondan hemen önce, istenmeyen ortamları ve ilgili bileşenleri çıkarmak için MSC tohumlu bir PLA iskelesini PBS'ye yavaşça daldırın. İskeleyi rezeksiyon boşluğuna implante edin.
Gerekirse, iskeleyi yerine sabitlemek için 1 mikrolitre fibrinojen ve ardından 1 mikrolitre trombin ekleyin. Dura çıkarılmış ve kraniyal pencereden kemik flebi atılmış durumdayken, cildi kapatarak ve cerrahi yapıştırıcı uygulayarak yarayı kapatın. Hayvanı solunan anestezikten çıkarın ve ısıtılmış bir yüzeyde iyileşmesine izin verin.