JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:15 dk. • July 8th, 2025
Bir beyin tümörü hücresi alt popülasyonu olan beyin tümörü kök hücreleri veya BTSC'ler, tümör büyümesini ve metastazı başlatabilir ve bu da onları kanser tedavisi için umut verici hedefler haline getirir. İlaçların in vitro olarak BTSC göçü üzerindeki etkisini incelemek için, önce uygun bir ortamda BTSC'lerin tek tip süspansiyonlarını hazırlayın. Süspansiyonlardan birini ilgilendiğiniz ilaçla tedavi edin.
Bu arada, her bir oyuğu üst ve alt odalara ayıran membranöz eklerden oluşan çok kuyulu bir kemotaksis plakası elde edin. İstenilen hücre dışı matriks proteinini alt odacıklara ve membranöz eklere pipetleyin. Proteinin polimerizasyonunu kolaylaştırmak için inkübe edin.
Alt odacıklara istenen kemoatraktanı içeren uygun bir bazal ortam ekleyin ve membranöz eklerin üzerine yerleştirin. Daha sonra, ilaçla muamele edilmiş ve işlenmemiş BTSC süspansiyonunu membranöz eklere tohumlayın. Canlı hücre mikroskobu kullanarak plakayı uzun süre görüntüleyin.
Kültürde, BTSC'ler ekin protein matrisine yapışır. Üst ve alt odacıklar arasında kurulan kemoatraktan konsantrasyon gradyanına yanıt olarak, tedavi edilmemiş BTSC'ler, zar ekleme gözeneklerinden alt odaya protein matrisi boyunca göç eder.
Bununla birlikte, ilaç tedavisi hücrelerin fonksiyonel aktivitesini olumsuz yönde etkileyerek BTSC göçünü azaltır. Şimdi, uygun bir yazılım kullanarak, alt odalardaki taşınan BTSC'leri analiz edin ve miktarını belirleyin. Tedavi edilmeyen BTSC'ler artmış migrasyon gösterirken, ilaçla tedavi edilen BTSC'ler azalmış migrasyon gösterir.
İlgilenilen bir ilaç tedavisinin göç üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, ilk olarak, hücreleri uygun bir deney süresi boyunca ilacın uygun konsantrasyonu ile ön işleme tabi tutun. Kemotaksis plakasını hazırlamak için, 37 santigrat derecede 1 saat boyunca mililitre tip-I kollajen başına sırasıyla 75 ve 225 mikrolitre 0.2 miligram ile 96 oyuklu bir kemotaksis plakasının koşuluna göre üç membran yerleştirme kuyusu ve üç alt rezervuar kuyusu kaplayın.
İnkübasyonun sonunda, kollajen kaplamayı çizmeden kollajen solüsyonunu her bir oyuktan aspire edin ve kuyucukları steril PBS ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, ek parçayı plakadan çıkarın ve kemotaksis plakasının her bir alt rezervuar kuyusuna %10 FBS ile desteklenmiş 225 mikrolitre büyüme faktörü içermeyen ortam ekleyin.
Ardından, kabarcık oluşmasını önlemek için üst parçayı belirli bir açıyla alt hazneye nazikçe geri koyun ve her bir ek parçaya 50 mikrolitre büyüme faktörü içermeyen ortamda üçüncü ayrışmış BTSC'lere 2,5 kez 10 ekleyin. BTSC'leri tek hücrelere tamamen ayırmak ve üst ekte hücre kümeleri veya çok fazla hücre olmasını önlemek için kaplamadan önce bunları dikkatlice saymak önemlidir.
FBS gradyanı boyunca BTSC göçünü görüntülemek için, plakayı canlı hücreli bir görüntüleme sistemine yerleştirin ve otomatik görüntüleme yazılımını, 72 saate kadar her 1 ila 2 saatte bir plakanın mikroskobik görüntülerini alacak şekilde ayarlayın. Görüntü alımı tamamlandığında, BTSC'leri zarın alt tarafındaki ek gözeneklerinden ayırt etmek için yeni bir işleme tanımı seçin ve hücreleri arka plan zarından gerektiği gibi doğru bir şekilde ayırt etmiyorsa analizi değiştirin.
Gözeneklerden göç eden hücreleri ölçmek için, verileri, koşul başına üç çoğaltma kuyusunun her biri için zarın alt tarafındaki hücre yüzey alanı olarak toplayın. Ardından, zaman içinde mikrometre kare cinsinden göç eden hücrelerin alanı olarak hücre göçünün grafiğini çizin.