JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:13 dk. • July 8th, 2025
Glioblastoma, beyindeki uzak yerleri istila etmek için miyelinli nöronların aksonal yolları boyunca göç eden kök benzeri hücrelere sahiptir. Glioblastoma veya GBM hücrelerinin in vitro nöronlar üzerindeki göçünü özetlemek için, bir cam lamel alarak başlayın.
Lameli oksijen plazma işlemi ile etkinleştirin ve işlevselleştirici bir madde ile astarlayın. Bu işlem, sonraki adımlarda kimyasallara kolay erişimi destekler. Lameli PEGile çözeltisini ekleyin ve inkübe edin. Bu solüsyon, rastgele yerlerde nöron yapışmasını önleyerek lamel kaplar.
Lamel üzerine bir foto başlatıcı polimer dağıtın ve görüntüleme odasına monte edin. Odayı bir floresan mikroskobu sahnesine yerleştirin. İçeri girdikten sonra, UV aydınlatması, öngörülen mikro modellere karşılık gelen belirlenmiş alanlarda foto başlatıcı molekülleri yerel olarak aktive eder.
Aktive edilmiş foto başlatıcı moleküller, alttaki PEG tabakasını parçalayarak istenen modeli oluşturur. Şimdi laminin çözeltisini ekleyin ve inkübe edin. Bir glikoprotein olan laminin, PEG tabakasının çıkarıldığı belirli yerlerde biriktirilir. Sıçan hipokampal nöronları içeren ortamı lamel üzerine tohumlayın.
Nöron-mikro desenli lameller elde etmek için nöronların laminin kaplı dizilere yapışmasına izin vermek için inkübe edin. Mikro desenli nöronların üzerine floresan etiketli GBM hücrelerinin bir süspansiyonunu biriktirin. Nöronlar üzerinde göç eden floresan GBM hücrelerini görmek için resim.
Mikro modelleme için bir substrat yapmak için, lamelleri 1 saat boyunca 100 mikrolitre 3-aminopropil trietoksisilan içeren bir desikatöre yerleştirmeden önce 18 milimetrelik dairesel cam lamelleri 5 dakika boyunca hava veya plazma aktivasyonu ile işlemden geçirin. Ardından, jel biriktirme için 1 saat boyunca mililitre başına 100 miligramda bir Peg-SVA çözeltisini inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, sürgünün ortasına 3 mikrolitre PLPP ve 50 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve tamamen kurumasını bekleyin.
Cam slayt mikro modelleme için, lameli bir Ludin haznesine monte edin ve hazneyi otomatik odaklama sistemi ile donatılmış bir mikroskop tablasına yerleştirin. Görüntülemeden sonra, mikro desenli görüntüleri yazılıma yükleyin. Otomatik UV aydınlatma sıralamasından sonra, PLPP'yi lamel den PBS ile kapsamlı bir şekilde yıkamak için bir pipet kullanın. Daha sonra, lamel mililitre laminin başına 50 mikrogram ile 30 dakika boyunca inkübe edin, ardından gösterildiği gibi PBS ile başka bir yıkama yapın.
Mikro desenli lameller üzerinde embriyonik bir sıçan hipokampal nöron kültürü kurmak için, son yıkamadan sonra cam slaytları nöronal hücre kültürü ortamı ile yeniden sulandırın. 37 santigrat derecede %5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 24 saatlik bir inkübasyon için her bir mikro desenli lamel üzerine santimetre kare başına %3 at serumu ile zenginleştirilmiş nörobazal ortamda asılı kalan nörobazal ortamda 5 kez 10 ila dördüncü sıçan hipokampal nöronlarını tohumlayın. Ayrışmış glioblastoma hücrelerini 1.000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin ve peleti glioblastoma hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, mikro desenli nöronlar üzerinde üçüncü GBM hücrelerine 1 çarpı 10 yatırın.