Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Merkezi sinir sisteminde perisitler, kılcal damarların iç hücresel astarını oluşturan endotel hücrelerini saran çok işlevli hücrelerdir. Perisitler kan akışını düzenlemeye ve beyin homeostazını korumaya yardımcı olur.

Perisitleri izole etmek için, donmuş sığır beyin kılcal damarlarını bir şişede alarak başlayın. Çözüldükten sonra, içeriği istenen ortamı içeren bir tüpe aktarın. Kılcal damarları peletlemek için santrifüjleyin. Dondurucu ortam içeren süpernatanı çıkarın. Kılcal peleti ortamdaki yeniden süspanse edin ve süspansiyonu hücre dışı matris proteini kaplı bir şişeye tohumlayın.

Kılcal damarların şişedeki kaplamaya yapışmasını sağlamak için inkübe edin. Ortamı heparin içeren ortamla değiştirin. Kültürde, hücre dışı matriks protein kaplaması, perisitlerin kılcal damar parçalarından uzaklaşmasını ve çoğalmasını teşvik ederken, heparin endotel hücre göçünü uyarır.

Harcanan ortamı heparin içeren ortamla değiştirin. Zamanla, perisitler şişeye güçlü bir şekilde yapışan uzun süreçler yansıtır. Sınırlı substrat alanı ile endotel hücreleri çoğalır ve teması inhibe edilmiş bir tek tabaka oluşturur. Uygun perisit yoğunluğuna ulaştıktan sonra, ortamı çıkarın ve şişeyi tamponla yıkayın.

Gevşek bağlı endotel hücrelerini şişeden ayırmak için tripsin-EDTA kullanın. Daha sonra, tripsin-EDTA aktivitesini nötralize etmek için ortam ekleyin. Ayrılmış endotel hücrelerini çıkarmak için tekrar tekrar ortamla yıkayın. Ortam ekleyin ve perisitlerin şişeye bağlı kaldığından emin olun. Çoğalmak için perisit bakımından zenginleştirilmiş kültürü kuluçkaya yatırın.

37 santigrat derece su banyosunda bir şişe kılcal damarı çözerek başlayın. Kılcal damarlar çözüldükten sonra, bunları 30 mililitre DMEM-comp içeren bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Ardından, ortamı tüpten çıkarın ve peleti 10 mililitre taze DMEM-comp içinde yeniden süspanse edin. Süspansiyonu kaplanmış bir T75 şişeye aktarın ve kılcal damarların% 10 karbondioksit ile beslenen 37 santigrat derece inkübatörde 4 ila 6 saat boyunca dibe yapışmasına izin verin. Kuluçka işleminden sonra, şişeyi ışık mikroskobu altında inceleyin.

Kılcal damarların fraksiyonları şimdi şişenin dibine tutturulmalıdır. 4. günde, kılcal damarları tohumladıktan sonra, yaklaşık% 60 ila% 70 birleşik olduklarından emin olmak için mikroskop altında inceleyin. Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile nazikçe yıkayın. 2 mililitre çözülmüş Tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi inkübatörde 1 ila 3 dakika bekletin, şişeyi sık sık çıkarın ve mikroskopla hücre ayrılmasını gözlemleyin. Endotel hücreleri toplanmaya başladığında, onları çıkarmak için şişeye hafifçe vurun.

Hücreler ayrıldığında, şişeye 10 mililitre DMEM-comp ekleyerek tripsinizasyonu durdurun. Şişeyi ortamla birkaç kez yıkayın ve artık başka amaçlar için kullanılabilen endotel hücre süspansiyonunu aspire edin. Şişeye 10 mililitre DMEM-comp ekleyin ve perisitlerin hala mevcut olduğundan ve tabana bağlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Ardından, perisit ile zenginleştirilmiş kültürün büyümesine izin vermek için şişeyi inkübatöre geri koyun.