Serebral Kılcal Damarların İnsan Beyninden İzolasyonu: İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarları Çıkarmak İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Serebral kılcal damarlar, kan-beyin bariyerinin hayati bir bileşenidir - çözünen maddelerin kan ve beyin arasında seçici hareketine izin veren yarı geçirgen bir bariyer. Serebral kılcal damarları izole etmek için taze insan beyin dokusu ile başlayın. Meninksleri çıkarın ve beyaz maddeyi doğrayın.

Beyin dokusunu daha küçük parçalara ayırın. Parçaları uygun bir tampon içeren bir homojenizatöre aktarın ve homojenize edin. Homojenizasyon, dokuları parçalayarak kılcal damarları ve doku kalıntılarını çözeltiye bırakır.

Homojenatı yeni bir tüpe aktarın ve optimum hacimde uygun yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Kılcal damarları peletlemek için çözeltiyi santrifüjleyin. Çok fazla veya çok az yoğunluk gradyan ortamı, düşük kılcal verime neden olur. Süpernatanı çıkarın.

Peletleri sığır serum albümini veya BSA takviyeli tampon içinde yeniden süspanse edin. BSA, sindirim enzimlerini stabilize eder ve kılcal damarların yapısal bütünlüğünü korur. Ardından, büyük damarları ve doku kalıntılarını gidermek için çözeltiyi uygun bir filtre ile filtreleyin.

Ardından, süzüntüyü daha küçük bir ağ filtreden geçirin. Bu filtre, serebral kılcal damarları tutar ve daha küçük döküntülerin ve kırmızı kan hücrelerinin geçmesine izin verir. Ardından, filtreyi çevirin ve kılcal damarları BSA takviyeli tampon içeren yeni bir tüpte yıkayın.

Çözeltiyi santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Saf kılcal damarları tamponda yeniden süspanse edin ve daha sonra kullanmak üzere saklayın.

Bu işleme başlamak için, yaklaşık 10 gram olması gereken insan beyin dokusunun ağırlığını belgeleyin. Mikroskop altında, tüm meninksleri forseps ile dikkatlice çıkarın ve beyaz maddeyi kesmek için bir neşter kullanın. Daha sonra beyin dokusunu dikkatlice kesin ve yaklaşık 5 dakika neşter ile kıyın.

Beyin dokusunu doku öğütücüye aktarın ve 30 mililitre izolasyon tamponu ekleyin. Ardından, her bir numuneyi 50 rpm'de 100 vuruşla homojenize edin. Kabarcıkları önlemek için havayı karıştırmayın. Her 25 vuruşta bir geçen süreyi ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belgeleyin. Daha sonra homojenatı buz üzerinde bir Dounce homojenizatöre aktarın. Süspansiyonu yaklaşık 20 vuruş homojenize edin ve kabarcıkları önleyin.

Ardından, beyin homojenatını dört adet 50 mililitrelik santrifüj tüpüne eşit olarak dağıtın ve homojenatın toplam hacmini belgeleyin. Doğru miktarda Ficoll eklediğinizden emin olun. Çok az veya çok fazla Ficoll, kılcal damarları hücresel döküntülerden ayırmak için yanlış bir yoğunluğa neden olacak ve böylece kılcal peleti azaltacak ve verimi sınırlayacaktır.

Havaneli ve homojenizatörü durulamak için 10 mililitre izolasyon tamponu kullanın ve dört santrifüj tüpüne dağıtın. Ardından, santrifüjleme tüplerine 50 mililitre yoğunluk gradyan tamponu dağıtın. Santrifüj tüplerini kapaklarla sıkıca kapatın. Daha sonra homojenatı, yoğunluk gradyan ortamını ve tüpleri kuvvetlice çalkalayarak tamponu karıştırın. 5,800 x g'da 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve her peleti 2 mililitre% 1 BSA içinde yeniden süspanse edin.

Peleti yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu 300 mikrometrelik ağdan süzün. Kılcal damarlar ağ boyunca süzülürken, daha büyük damarlar ve daha büyük beyin kalıntıları ağ üzerinde kalır. Ağı 50 mililitreye kadar %1 BSA ile dikkatlice yıkayın, ardından ağı atın. Kılcal damarları kırmızı kan hücrelerinden ve diğer beyin kalıntılarından ayırmak için, kılcal filtratı 530 mikrometre hücre suş filtrelerinin üzerine dağıtın.

Kılcal damarlar bu filtre tarafından tutulurken, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreler ve küçük beyin kalıntıları filtreden geçer ve süzüntüde toplanır. Ardından, her filtreyi 25 mililitre% 1 BSA ile yıkayın. Verimi artırmak için tüm filtratları altıncı filtrenin üzerine dökün. Her filtreyi 50 mililitre% 1 BSA ile yıkayın. Kılcal damarları içeren hücre suş filtrelerini saklayın ve süzüntüyü atın. Daha sonra filtreleri ters çevirin ve kılcal damarları 50 mililitre% 1 BSA ile 50 mililitrelik tüplere yıkayın.

Pipet ucuyla nazikçe baskı uygulayın ve beyin kılcal damarlarını yıkamak için filtrenin üzerinde hareket ettirin. Tüm beyin kılcallarını, özellikle filtrenin kenarından yıkadığınızdan emin olun. Kabarcıklardan kaçının çünkü bu, filtreleme işlemini daha zor hale getirir ve kılcal damar kaybı olasılığını artırır. Kılcal damarları topladıktan sonra, tüm numuneleri 1.500 x g'da 4 santigrat derecede 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti yaklaşık 3 mililitre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Ardından, bir numuneden alınan tüm yeniden askıya alınmış peletleri 15 mililitrelik konik bir tüpte birleştirin ve izolasyon tamponu ile doldurun. 1.500 x g'da tekrar 4 santigrat derecede 3 dakika santrifüjleyin ve iki kez daha yıkayın. Kılcal saflığı 100X büyütmede mikroskop ve kamera ile belgeleyin. İzole edilmiş beyin kılcal damarları artık deneyler için kullanılabilir, işlenebilir veya dondurulabilir ve eksi 80 santigrat derecede kriyotüplerde en az 6 ila 12 ay saklanabilir.