Floresan Peptit Zimografi: Zymogram Jellerinde Florojenik Substratlar Kullanılarak Proteaz Aktivitesini Tespit Etmek İçin Modifiye Edilmiş Bir Teknik

Zimografi, hidrolitik enzimleri ve aktivitelerini tespit etmek için poliakrilamid jel ile kopolimerize edilmiş bir protein substratı içeren elektroforetik bir tekniktir. Başlamak için, numuneleri gliserol, sodyum dodesil sülfat veya SDS ve bromofenol mavisi içeren bir zimografi tamponunda çözün.

Gliserol, numune tamponunu jelin çevresindeki çalışan tampondan daha yoğun hale getirerek jel ceplerine kolay yükleme yapılmasını sağlar. Anyonik bir deterjan olan SDS, numunedeki enzimleri denatüre eder ve bunları negatif bir yükle kaplar. Bir izleme boyası olan bromofenol mavisi, jeldeki numune ilerlemesinin izlenmesine yardımcı olur.

Proteaz aktivitesini tespit etmek için numuneleri florojenik substratlarla gömülü poliakrilamid jel içine yükleyin. Şimdi elektrotları bağlayın ve elektroforeze başlayın. Üretilen elektrik alanı, SDS'ye bağlı tüm enzimlerin jel boyunca pozitif yüklü elektrota doğru göç etmesine neden olur.

Elektroforezin tamamlanmasının ardından, jeli çıkarın ve enzim renatürasyonuna izin vermek için SDS'nin yerini alan iyonik olmayan deterjan içeren bir renatüre edici tamponda yıkayın. Daha sonra, jeli, jeldeki enzimleri aktive eden iki değerlikli katyonlar içeren gelişmekte olan bir tamponda inkübe edin.

Aktif proteazlar, florojenik substratları parçalayarak floresansta bir artışa neden olur. Yoğunluğu proteaz aktivitesi ile orantılı olan floresan protein bantlarını gözlemlemek için jeli görüntüleyin.

Başlamak için, numuneleri geleneksel zimografi numune tamponunda çözün. Jel aparatına 400 mililitre 1x Tris-Glycine SDS çalışma tamponu ekleyin. Kuyucuk başına 35 mikrolitreye kadar numune yükleyin. Numuneleri 1.5 saat boyunca 4 santigrat derecede 120 voltta veya moleküler ağırlık standartları, ilgilenilen proteazların peptit çözücü jel tabakası içinde olduğunu gösterene kadar çalıştırın. Bundan sonra, jelleri plastik kasetten çıkarın.

Jöleleri, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde, oda sıcaklığında oda sıcaklığında renatüre edici tamponda üç kez yıkayın. Jelleri 15 dakika boyunca gelişmekte olan bir tampon çözeltisine aktarın. Daha sonra, çözeltiyi taze gelişen tampon ile değiştirin ve 24 saat boyunca hafif çalkalama altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, jelleri görüntülemek için uygun uyarma ve emisyon filtrelerine sahip bir floresan jel tarayıcı/görüntüleyici kullanın.