JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:19 dk • July 8th, 2025
Sırtüstü pozisyonda yerleştirilmiş hamile anestezi uygulanmış bir dişi fare modeli alarak başlayın. Karın bölgesindeki tüyleri alarak fareyi hazırlayın. Canlı embriyolara ev sahipliği yapan bölgeler olan uterus boynuzlarını ortaya çıkarmak için cildi ve alttaki kas katmanlarını kesin.
Şimdi, rahim boynuzlarını karın boşluğundan dışarı çekin. İstenilen plazmit DNA çözeltisini içeren keskin uçlu bir cam kılcal damar alın. Embriyonun beynini bulun ve plazmit DNA çözeltisini rahim duvarından dördüncü ventriküle enjekte edin. Bu pozisyon, nihai DNA iletimi için istenen yer olan serebellar primordiumun önündedir.
Enjeksiyondan sonra boş kılcal damarı geri çekin. Daha sonra, DNA enjekte edilen embriyonun elektroporasyonu için, iki elektrotu uterus duvarının üzerine, pozitif elektrot serebellar primordium'u ve negatif elektrot kulakların etrafındaki bölgeyi kaplayacak şekilde konumlandırın.
İstenilen süre boyunca elektrik darbeleri uygulayın. Bu darbeler, serebellar nöronal hücreleri geçirgen hale getirerek plazmit DNA'nın hedeflenen hücrelere girmesine izin verir. Son olarak, rahim boynuzlarını doğal pozisyonlarında karın boşluğunun içine geri yerleştirin. Kesikleri dikin, fareyi kafesine aktarın ve iyileşmesine izin verin.
Bir borosilikat cam kılcal damarı bir mikropipet çekiciye yükleyerek ve ince bir uç oluşturmak için çekerek başlayın. Enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için kılcal ucu siyah mürekkeple etiketleyin ve camın üzerine bir ölçek çizin. Stereomikroskop altında çalışarak, ucu yaklaşık 6 milimetre uzunluğa kadar kesmek ve keskin, tek taraflı eğimli bir kenar oluşturmak için bir cetvel ve keskin iğne cımbızı kullanın.
Çözeltiden boya parçacıklarını çıkarmak için %1'lik bir Fast Green stok çözeltisini 0,22 mikronluk bir filtreden süzün. Tek kılavuzlu RNA plazmitlerini, her bir plazmit için mililitre başına en az 1 mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar lusiferaz raportör plazmidi ile eşit parçalar halinde karıştırın.
Plazma çözeltisini% 0.05'lik bir nihai konsantrasyonda Fast Green ile renklendirin. Hamile bir CD-1 faresini izofluran ile uyuşturduktan sonra, fareyi bir ısıtma yastığına sırt üstü yerleştirin ve analjezik uygulayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi sürün. Uzuvları bantla sabitleyin ve karnı bir dezenfektanla sterilize edin.
Fareyi gazlı bezle örtün ve yalnızca cerrahi alanı açıkta bırakın. Yaklaşık 2 santimetre uzunluğunda bir cilt kesisi yaptıktan sonra, linea alba'yı bulun ve peritondan biraz daha küçük ikinci bir kesi yapmak için künt uçlu doku makası kullanın. Açılan karın boşluğunu önceden ısıtılmış steril PBS ile nemlendirin.
Daha sonra, uterus boynuzlarını karın boşluğundan dikkatlice çıkarmak için halka forseps kullanın. İki komşu embriyonun yumurta sarısı keseleri arasındaki boşlukta uterus duvarını kavrayın ve hafifçe çekin. Embriyoyu kesiden çekerken üzerine herhangi bir baskı uygulamaktan kaçının. Rahim boynuzları çıkarıldıktan sonra, hazırlanan cam kılcal damar ile yaklaşık 10 ila 15 mikrolitre renkli plazmit solüsyonu aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcığından kaçının.
Embriyoyu halka forseps ile nazikçe tutun ve boyun bölgesini bulun. Cam kılcal damarın ucuyla dorsal arka beyne yavaşça nüfuz edin ve dördüncü ventriküle doğru hareket edin. Plazmit karışımından yaklaşık 1 mikrolitre enjekte edin. Boyanmış DNA'nın beyinden sızmadığını ve elmas şeklinde bir yapı olarak görünür olduğunu doğrulayın.
Burada, DNA'yı serebellar primordiumun distal kısmına da iletmek için dördüncü ventrikülün tüm bölgesini plazmit solüsyonu ile doldurmak en önemlisidir. Aynı zamanda, bu işlem sırasında herhangi bir kanamaya neden olmadığınızdan emin olun.
5 milimetre çapında elektrot plakaları ile donatılmış platin cımbızları, kulağı kaplayan negatif kutup ve serebellar primordiumda konumlandırılan pozitif kutup rahim duvarı üzerine gelecek şekilde embriyonun başının üzerine yanal olarak yerleştirin ve elektrikli kare darbeler uygulayın.
Tüm embriyolar elektropore edildiğinde, uterus boynuzlarını dikkatlice karın boşluğuna geri yerleştirin ve steril PBS ile doldurun. Rahim boynuzunun doğal bir pozisyona kaymasına izin verin. Anesteziyi kapatın ve iyileşmesi için hayvanı göbeği aşağı gelecek şekilde yeni bir kafese koyun.