JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 4:17 dk. • July 8th, 2025
Ortotopik transplantasyon sırasında, tümör hücreleri veya tümör taşıyan bir donörden alınan doku, aynı türden bir alıcının karşılık gelen dokusuna nakledilir. İlk olarak, tümör taşıyan bir zebra balığından toplanan floresan etiketli beyin tümörü hücrelerinin uygun bir tampon içinde düzgün bir süspansiyonunu hazırlayın. İnce bir jel yükleme ucu kullanarak, bu hücre süspansiyonunu bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin.
Ardından, yüklenen iğneyi bir mikromanipülatörün tutucusuna sabitleyin. Daha sonra, uyuşturulmuş bir zebra balığı embriyosunu prefabrike bir enjeksiyon plakasına aktarın. Mikroenjeksiyon sırasında kolay erişim için, beyin ventriküllerini görselleştirmek için embriyoyu yanal olarak konumlandırın - beyin içinde beyin omurilik sıvısı dolu boşluklardan oluşan bir ağ.
Tümör hücresi süspansiyonunu, embriyonun arka beyninin elmas şeklindeki boşluğu olan dördüncü ventriküle enjekte etmek için iğne ucunu ayarlayın. Tümör hücreleri ventrikül içindeki içi boş alanı işgal eder. İğneyi geri çekin. Embriyoyu tuzlu su içeren bir kültür kabına aktarın. Ventrikül boşluğundaki tümör hücrelerinin varlığını doğrulamak için embriyoyu bir floresan stereomikroskop altında gözlemleyin.
Embriyoyu kuluçkaya yatırın. Enjeksiyondan birkaç saat sonra, tümör hücreleri göç eder ve çevredeki beyin dokusunu istila eder, burada daha sonra çoğalarak yeni tümörlere yol açar. Zamanla, tümör hücreleri çoğalır ve daha fazla istila ederek beyne yayılır.
Bir transfer pipeti kullanarak, 10 ila 20 anestezi uygulanmış embriyoyu enjeksiyon plakasının çevresine aktarın. Embriyolar, ventriküller açıkça görülebilecek ve erişilebilir olacak şekilde yanal olarak düşmelidir. Embriyoları gerektiği gibi ayarlamak için açılı bir prob kullanın ve bunları enjeksiyon plakasının dış kenarından uzağa yerleştirin.
Ardından, 1 ila 2 mikrolitre tümör hücresi süspansiyonunu enjeksiyon iğnesine yüklemek için bir jel yükleme ucu kullanın ve iğneyi manipülatöre yerleştirin. Ardından, iğneyi 45 derecelik bir açıyla tutarak manipülatörü manuel olarak indirin. Mikromanipülatörün düğmelerini x, y ve z yönlerinde, iğne embriyo başının hemen üstünde ve yaklaşık 5 milimetre sağında olana kadar ayarlayın.
Bir stereomikroskop kullanarak, iğne embriyonun dördüncü ventrikülünü delene kadar mikromanipülatörü x yönünde yavaşça ayarlayın. İğnenin kalbi veya yumurta sarısını delmesine izin vermeyin. Tutarlı enjeksiyonlar için embriyoların uyuşturulması gerekir. Tümör hücresel bir süspansiyona uygun şekilde ayrıştırılmalı ve iğne dördüncü ventrikülü delmeli, ancak kalbin ötesine uzanmamalıdır.
Tümör hücresi süspansiyonunu enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına basın. Enjekte etmeyi bitirdiğinizde, enjekte edilen embriyoları enjeksiyon plakasından nazikçe durulamak ve bir Petri kabına koymak için taze yumurta suyu kullanın. Şimdi, enjekte edilen embriyoları karanlık bir odada floresan stereomikroskop altında inceleyin. Enjeksiyon basıncının, açısının, iğne boyutunun ve hücre süspansiyon viskozitesinin, tümör hücrelerinin ventrikül boşluğunun %25 ila %50'sini doldurmasına neden olduğunu onaylayın.
Embriyoları gece boyunca 28 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin. Ertesi gün, daha önce tarif edildiği gibi normal kalp ve beyin gelişimi gibi morfolojik ve fizyolojik özellikleri inceleyerek embriyo sağkalımını değerlendirin.