SB Aracılı Transpozisyon Kullanılarak Glioblastoma İndüksiyonu: SB Plazmidinin Yenidoğan Fare Beynine Transpozon Aracılı Entegrasyonu Kullanılarak Yeni Fare Modeli Oluşturmak İçin Bir Teknik

Plazmit karışımı içeren bir tüp alarak başlayın. Uyuyan güzel veya SB transpozon plazmidi, iki ters çevrilmiş tekrar dizisi arasına sıkıştırılmış, insan kaynaklı glioblastoma indükleyen bir onkogen içeren transpoze edilebilir bir element taşımak üzere tasarlanmıştır. Ek olarak, bu karışım, bir transpozaz enzimi eksprese eden elemente sahip bir SB transpozaz plazmidi içerir.

Şimdi, tüpe uygun bir transfeksiyon reaktifi ekleyin. Enjeksiyon karışımını bir mikroiğne ile donatılmış bir şırıngaya aspire edin. Ardından, anestezi uygulanmış bir fare yavrusunu stereotaksik bir çerçeve üzerinde yüzüstü pozisyonda sabitleyin. Kraniyal dikişleri bulmak için yavrunun baş bölgesini görselleştirin. Mikroiğneyi kraniyal sütürlerin üzerine yerleştirin.

Karışımı, beyin parankimi içindeki bir boşluk olan lateral ventriküle enjekte edin. Daha sonra, çözelti, transfeksiyon reaktif moleküllerinin hücrelere plazmitlerin girişini kolaylaştırdığı beyin parankimine dağılır. Hücrenin içine girdikten sonra, transpozaz plazmidi, ters çevrilmiş tekrar dizilerini tanıyan ve transpozon elementini eksize eden transpozaz enzim moleküllerini ifade eder.

Transpoze edilebilir element DNA'sı daha sonra kendisini yavrunun genomik DNA'sının TA tekrar bölgesine yeniden entegre eder. Genetik transpozisyon, beyin hücrelerinin onkojenik bir dönüşümüne neden olur ve fare beyninde glioblastoma gelişmesine yol açar.

Deneyden 3 ila 4 hafta önce, bir erkek ve bir dişi ile bir fare yetiştirme kafesi kurun. Çevreyi zenginleştirmek ve çiftleşme şansını artırmak için renkli bir plastik iglo ekleyin. Hamilelik onaylandıktan sonra erkeği çıkarın ve çiftleşme gününden 18 gün sonra dişiyi doğum için izlemeye başlayın. Doğum sırasında bir taşıyıcı annenin hazır olduğundan emin olun.

Doğum sonrası ilk gün, intraventriküler enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyon çözeltisini, önce transpozon plazmitlerini içeren DNA karışımının 20 mikrolitresini, mikrolitre başına 0.5 mikrogram DNA'lık bir nihai konsantrasyonda alikote ederek hazırlayın. Daha sonra, DNA çözeltisine 20 mikrolitrelik bir PEI çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika ila bir saat boyunca inkübe etmelerine izin verin, ardından karışım buz üzerinde saklanmalıdır.

Enjeksiyon iğnesi için, 12,5 derece eğimli 30 gauge hipodermik iğneye 10 mikrolitrelik bir şırınga takın. Ardından, şırıngayı otomatik enjeksiyonlu bir pompaya takın. Kurulumu 10 mikrolitre su ile test edin ve şırıngayı boşalttığınızdan emin olun. Şimdi, yenidoğan stereotaksik aşamasını bir kuru buz ve alkol bulamacı ile soğutun. 2 ila 8 santigrat dereceye kadar soğutulduğunda, enjeksiyonlara devam edin.

Bir yavruyu 2 dakika boyunca buzun üzerine koyarak uyuşturun. Yavru buz üzerindeyken, şırıngaya enjeksiyon solüsyonu yükleyin. Anestezi uygulandıktan sonra, yavruyu çerçeveye aktarın ve başını gazlı bezle kaplı kulak çubukları arasında hareketsiz hale getirin. Kafatasının sırt tarafının yatay ve çerçeve yüzeyine paralel olduğunu kontrol edin. Ayrıca, kraniyal sütürler açıkça görülebilir olmalıdır.

Yavrunun kafası yeterince sıkı bir şekilde hareketsiz hale getirilmezse, enjeksiyon sırasında hareket eder, oysa çerçevenin kulak çubukları arasında çok sıkı bir şekilde sıkılırsa, lambda görünmez ve kafa içindeki basınç enjekte edilen çözeltiyi dışarı sızmaya zorlar.

Yavru çerçeve tarafından sıkıca kavranırken, kafayı %70 etanol ile silin. Ardından iğneyi indirin ve konumunu lambda ile temas edecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, iğneyi kaldırın ve yanal olarak 0,8 milimetre ve rostral olarak 1,5 milimetre hareket ettirin. Ardından, cildi hafifçe çukurlaştırana kadar tekrar indirin. Bu konumun koordinatlarını kaydedin. Ardından, iğneyi deriden ve kafatasından 1,5 milimetre indirin ve lateral ventriküldeki kortekse indirin.

Orada, 90 saniye boyunca 0.75 mikrolitre enjekte edin ve çözeltinin dağılması için bir dakika bekleyin. Beklerken enjekte edilecek bir sonraki yavruya anestezi yapılabilir. Bekledikten sonra iğneyi yavaşça kaldırın. Ardından, yavruyu bir ısıtma lambasının altındaki bir kurtarma konumuna aktarın. Anesteziden ısınmaya kadar geçen süre 10 dakikadan az olmalıdır; Ne kadar hızlı olursa o kadar iyi.

Solunumunu izleyin ve gerekirse nefes almayı teşvik etmek için uzuvları hafifçe ovalayın. Yavru ısındığında, pembe bir renge ve sabit bir nefese sahip olduğunda, annesine geri verin.